综述：用于培养肉制造的高级3D（生物）打印技术

《Journal of Future Foods》：Advanced 3D (Bio)Printing Strategies for Cultivated Meat Fabrication

　　3D（生物）打印技术通过精准控制细胞和生物墨水沉积，有效模拟天然肉类的纤维结构、脂肪分布及机械性能，在牛肉、鱼类和猪肉的培育中取得显著进展。当前主流技术包括挤出式、光固化及微流控打印，分别通过预制支架或直接细胞负载实现多组织协同构建。但规模化生产、食品级生物墨水开发及细胞存活率仍是主要挑战。

　　随着全球对可持续和伦理蛋白来源的需求不断增长，细胞培养肉（cultivated meat）作为一种传统畜牧业的替代方案，正逐渐成为食品生物技术和可持续性领域的重要创新。传统畜牧业不仅对环境造成巨大负担，包括温室气体排放、森林砍伐和水污染，还经常因密集型工厂化养殖而损害动物福利，并增加食品安全风险。此外，抗生素的过度使用进一步加剧了抗菌耐药性的传播。面对这些挑战，细胞培养肉技术的出现为满足全球日益增长的蛋白质需求提供了一种更加环保和人道的选择。它通过在受控环境中直接培养动物细胞来生产肉类，这些细胞在培养过程中被组织成与天然肉类结构相似的形态，从而提供类似的口感、质地和营养成分。据Straits Research报告，2024年全球细胞培养肉市场价值约为10.3亿美元，预计到2033年将达到107.6亿美元，复合年增长率（CAGR）为16.5%。

细胞培养肉的核心优势在于其能力来解决现代食品生产中的一些关键问题，如满足蛋白质需求的同时减少环境和伦理影响。通过消除动物屠宰的需求和降低资源消耗，细胞培养肉提供了更可持续和人性化的替代方案。其在无菌、受控环境中的生产过程还降低了污染、食源性疾病的传播以及抗生素使用的风险，进一步凸显了其作为更安全和伦理蛋白来源的潜力。然而，技术上最具挑战性的部分之一是复制传统肉类的复杂结构，特别是其纤维质地、大理石纹（intramuscular fat分布）和感官属性。

为了应对这些结构和功能上的挑战，3D打印和3D生物打印技术成为细胞培养肉制造的重要工具。这些增材制造（AM）技术使设计和生产具有前所未有的精确度和复杂性的肉类结构成为可能。与其他结构化方法如冻干支架、脱细胞支架、静电纺丝和模具铸造相比，3D（生物）打印提供了对不同细胞类型和基质成分放置的更精细控制。多材料打印策略可以实现肌肉、脂肪和结缔组织的共沉积，从而增强最终产品的质地和口感。此外，3D（生物）打印的可编程特性为其大规模生产提供了可扩展性和自动化潜力。然而，目前仍然存在一些限制，例如开发具有可调流变学和机械特性的食品级生物墨水仍然是一个主要障碍。同时，当前的打印系统往往缺乏大规模食品制造所需的生产速度和吞吐量。相比之下，传统的结构化方法虽然在成本效益和扩展性方面表现良好，但难以复制天然肉类组织的细胞复杂性和微结构各向异性。这些互补的优势和局限性使3D（生物）打印成为一种独特而有前景的方法，尽管它仍处于发展阶段。

在这一背景下，3D（生物）打印技术主要分为两大类：一类是打印食品级支架后进行细胞播种，另一类是直接使用细胞负载的生物墨水进行生物打印。第一种方法涉及制造由食品安全、生物相容性材料组成的无细胞支架，随后将其与细胞结合。这种方法的优点在于可以在引入细胞之前独立优化支架的特性，如孔隙率、机械强度和表面化学性质，从而为细胞附着、增殖和排列提供稳定的三维环境。然而，这种方法的一个主要限制是难以实现细胞在较厚支架中的均匀分布，导致组织发育不均匀。因此，整体成熟过程往往需要更长的时间，从而增加生产时间和成本。此外，支架降解需要谨慎平衡，过快的降解可能会影响组织发育，而过于稳定的支架则可能对最终产品的质地或消化性产生负面影响。

相比之下，直接打印细胞负载的构建物能够实现细胞的均匀分布，从而促进更快和更一致的组织形成。这种方法还能够在一个制造步骤中实现多种细胞类型（如肌细胞、脂肪细胞、成纤维细胞）和墨水的空间排列，使得复杂的、多组分的结构得以制造，这些结构能够很好地模仿真实肉类的层次结构，包括大理石纹和肌肉-脂肪整合等特征。然而，生物打印也面临显著的技术挑战，如细胞在墨水中的剪切应力可能会影响其活性和功能。此外，开发适合的生物墨水需要仔细优化流变学特性，以确保可打印性、机械完整性以及细胞兼容性。在许多情况下，生物打印的构建物表现出较差的机械稳定性，这使得化学交联剂的使用成为必要，但化学交联剂的使用可能会引发食品安全和监管批准方面的担忧。尽管如此，两种方法在细胞培养肉生产中都具有独特而互补的优势。无细胞支架的打印提供了优越的材料多样性和结构稳定性，使其适用于可扩展的食品安全应用。而细胞负载的生物打印则在实现空间复杂性方面表现出色，可能在感官和营养结果方面具有潜在优势。

在细胞培养肉的生产过程中，3D打印支架的技术取得了显著进展。例如，使用浸渍旋转喷丝技术制造了微纤维状的明胶支架，用于培养牛和兔的肌肉细胞。这些支架能够高通量生产，其直径可调，与天然胶原蛋白相似。通过化学或酶促交联，提高了支架在细胞培养期间的稳定性。这些支架支持了细胞的附着、增殖和排列，其中短纤维促进了细胞聚集，而长纤维则有助于各向异性肌肉组织的形成。尽管这些工程构建物缺乏成熟的收缩结构，但它们成功地复制了传统肉类的关键结构和机械特征。

另一个研究开发了富含植物蛋白的支架，包括豌豆蛋白分离物（PPI）和大豆蛋白分离物（SPI），结合了RGD修饰的海藻酸盐和多孔颗粒，以支持牛卫星细胞（BSC）的附着和成熟。利用3D打印的灵活性，制造了具有密集、平行内纤维的纤维状构建物，以模仿肌肉纤维的取向。这些支架支持了BSC的成功肌生成，而使用PPI丰富的生物墨水进行生物打印则实现了高细胞存活率（约80-90%）并促进了肌肉分化，展示了将植物来源成分纳入支架设计的可行性。

除了肌肉组织，研究还致力于复制大理石纹肉类的复杂性，通过结合肌肉和脂肪组织。例如，通过3D打印的藻酸盐或I型胶原蛋白水凝胶珠，首先将牛间质干细胞（BMSC）分化为脂肪细胞，其中藻酸盐表现出更优的脂肪积累。随后，将肌肉支架与纵向排列的牛卫星细胞（BSC）结合，以促进肌生成。成熟的脂肪细胞随后被叠加在肌肉支架上并重新交联，形成复合构建物，这些构建物能够很好地模仿传统肉类的肌内和肌间脂肪分布，从而改善风味、多汁性和质地。

在3D生物打印细胞培养肉方面，研究人员探索了多种策略。例如，使用一种新型的生物打印方法，通过定向打印路径引导细胞排列，以实现纤维的对齐。此外，通过使用含有淀粉纳米颗粒的生物墨水，提高了打印的可打印性和机械性能，同时促进了细胞附着和分化。研究还开发了可食用多孔微载体（EPMs），通过调控NaCl对冰晶生长的影响，支持大规模细胞扩展。这些微载体为肌肉卫星细胞和脂肪来源的干细胞提供了理想的附着和分化环境。此外，研究还利用鱼肌肉细胞粉（FMCP）和藻酸盐-κ-卡拉胶（Alg–κ-Car）生物墨水，制造了模仿鱼肉结构的生物打印构建物。FMCP作为一种高蛋白、生物相容性材料，提高了细胞的增殖能力，并赋予生物打印构建物功能上的优势。Alg–κ-Car–FMCP生物墨水表现出良好的流变特性，提高了打印后的结构完整性，并在煮沸和油炸过程中保持了其形态。通过电子舌分析，这些构建物展现出强烈的鲜味特征，超过了天然鱼肉。此外，通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析，证实了FMCP成功地被整合到水凝胶基质中。该生物墨水还表现出对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抗菌活性，这可能是由于FMCP与水凝胶基质的协同作用。此外，该研究还建立了一种连续的鱼细胞系，支持长期培养、加工和扩展性。

为了进一步提升3D生物打印细胞培养肉的性能，研究人员开发了多种先进的生物打印策略。例如，Filamented Light（FLight）生物制造策略是一种新型的 vat 光聚合技术，利用光波导的自聚焦效应，在短时间内形成定向的水凝胶微纤维网络，直径范围为2至30微米，与天然肌肉纤维的尺度相匹配。这种技术通过光学调制不稳定性诱导快速且局部的光聚合，从而在不使用化学交联剂的情况下，实现高细胞存活率。FLight支持多种光引发剂，并允许通过调整光投影角度来制造厘米尺度的构建物，具有可调的纤维取向。这些特性提供了强大的细胞引导信号，促进对齐、细胞核拉长和细胞外基质（ECM）沉积，这些是功能性肌肉组织的标志。然而，FLight技术依赖于光交联材料，其中许多并非食品级，且在低细胞密度（约10^6 cells/ml）下，光散射可能干扰波导形成，导致不均匀的微结构和对齐精度降低。此外，该技术的有效构建体积受限于光学扩散、散射和同步性问题，这在食品应用中的可扩展性提出了挑战。

为了克服 vat 光聚合方法的局限性，机械生物打印方法逐渐受到关注。例如，通过使用移动刀片在沉积过程中施加剪切应力，激活机械转导通路，引导细胞对齐并促进脂肪来源的干细胞（ASCs）的肌生成。这种方法不同于化学驱动方法，完全依赖机械刺激，从而避免了对生物化学信号的需求。这使得体外肌生成和体内组织再生优于传统方法。此外，该技术的简单性和可扩展性使其特别适合工业应用。然而，要实现细胞的均匀对齐和构建物的结构一致性，需要精确控制刀片运动和打印参数。成功在细胞培养肉领域应用将取决于开发稳健和可重复的打印工作流程。

此外，垂直3D冷冻生物打印技术引入了一种新颖的方法，利用冷冻保护生物墨水和温度控制的冷冻板，实现垂直水凝胶纤维的形成。这种垂直配置促进了骨骼肌母细胞的对齐、细胞扩展和机械坚固性，这些特性对于工程肌肉样结构至关重要。该平台还支持多材料打印，使其适用于制造肌肉-肌腱或肌肉-血管复合结构。此外，垂直打印还为工程大理石纹肉类结构提供了途径，通过交替沉积富含脂肪和肌肉的生物墨水，实现对脂肪-肌肉比例的精确控制，从而增强多汁性、风味释放和口感。然而，该技术目前受限于约6毫米的构建高度，因为冷冻条件的限制。此外，精确的热调节和冷冻保护剂的使用增加了将其适应于食品级生产的复杂性。

除了结构对齐，混沌生物打印技术提供了一种独特的策略，以复制传统肉类的异质性和大理石纹。该技术利用静态混合器嵌入共轴微流体装置，通过连续挤出生成具有嵌入各向异性微地形的多组分水凝胶纤维。通过同时打印GelMA和藻酸盐组分，该方法在细胞支持和机械强度之间提供了协同平衡，其中GelMA促进细胞增殖和分化，而藻酸盐提供方向性机械信号。混沌生物打印的关键优势在于其高度的可调性，通过调整流速、组分比例和离子浓度，可以精确控制纤维的架构和对齐。然而，实现一致的结构保真度需要在组分之间平衡流变学特性，并优化喷嘴尺寸和交联动力学。

这些先进的3D生物打印策略为解决细胞培养肉生产中的一个主要挑战提供了有力工具：复制天然肌肉组织的纤维对齐和分层组织结构。FLight和垂直冷冻生物打印技术提供了高分辨率的空间控制，而刀片辅助和混沌生物打印则提供了可扩展的、机械驱动的方法。尽管这些方法前景广阔，但每种方法在可扩展性、生物墨水兼容性和食品安全法规方面都有权衡。未来的研究应集中在开发食品级材料、将3D生物打印与高通量系统集成，以及优化生物打印参数以适应肉类制造的需求。这些创新为生产高度仿真的细胞培养肉铺平了道路，这些肉类能够很好地模仿优质动物衍生产品的感官特性。

随着3D生物打印技术在细胞培养肉领域的应用逐渐成熟，一些关键考虑因素必须得到解决，以推动从实验室规模原型向可扩展、商业化的细胞培养肉产品的转变。这些关键考虑因素包括：（1）开发食品级、可食用的生物墨水；（2）提高高分辨率、多材料打印能力；（3）保持细胞的活性和功能；以及（4）确保打印平台的可扩展性以满足工业生产需求。首先，开发生物墨水是细胞培养肉生物打印的基础，这些生物墨水不仅需要生物相容性，还需要符合食品安全标准。与传统组织工程应用不同，细胞培养肉要求生物墨水既能支持细胞增殖和分化，又能适合人类食用。虽然近年来天然衍生材料如明胶、藻酸盐、纤维蛋白和各种植物多糖在这一领域取得了积极进展，但未来的研究需要进一步优化这些材料，以满足功能性表现和感官期望，从而提高其在大规模细胞培养肉应用中的适用性。

其次，为了复制传统肉类的复杂结构，包括对齐的肌肉纤维、分散的脂肪沉积和结缔组织基质，实现高分辨率的多材料打印是至关重要的。这一能力是再现真实肉类质地、外观和感官特性的关键使能因素。最近在喷嘴设计、多材料打印系统和实时反馈机制方面的创新正在帮助克服当前的限制，扩大结构化肉类构建物的复杂性。通过继续完善这些系统，制造商可以增强3D（生物）打印细胞培养肉的建筑保真度和感官真实性，从而提高消费者接受度。

第三，保持高细胞活性和功能是成功开发细胞培养肉的关键。根据不同的打印方式，细胞可能受到各种机械和环境应力的影响，如剪切力、液滴冲击和光毒性暴露，这些都可能影响其存活和活动。在涉及肌肉细胞、脂肪细胞、成纤维细胞和其他具有不同应力敏感性的支持细胞类型的共培养系统中，确保打印后细胞的高活性尤为重要。这有助于促进功能性、类组织构建物的形成。

最后，确保打印平台的可扩展性对于细胞培养肉的工业生产至关重要。尽管当前平台在小规模生产中已显示出可行性，但它们在吞吐量、构建体积和过程一致性方面仍面临挑战。新兴技术如并行喷嘴阵列和机器学习（ML）算法的整合，为优化和标准化打印参数提供了有希望的路径。此外，3D（生物）打印与下游过程如组织成熟、灌注生物反应器和后期处理流程的无缝整合，对于在工业规模上保持产品质量、安全性和成本效益至关重要。

综上所述，生物墨水开发、打印精度、细胞活性和可扩展性这四个方面是推动3D（生物）打印在细胞培养肉制造中进步的关键支柱。通过以解决方案为导向的方法解决这些问题，不仅能够加速技术进步，还能帮助弥合概念验证研究与实际应用之间的差距。通过实现结构化、功能性和伦理性的肉类产品，3D（生物）打印在塑造可持续食品制造的未来方面具有独特的潜力。