利用代谢组学和化学计量学方法研究储存条件对婴儿菠菜中酚类化合物稳定性及其抗氧化活性的影响

《Applied Food Research》：Metabolomics and Chemometrics Approaches to Investigate Storage Impact on Phenolic Compounds Stability and Their Antioxidant Activities in Baby Spinach

　　小菠菜储存温度对酚类化合物组成及抗氧化活性的影响研究采用LC-ESI-QTOF-MS/MS代谢组学方法分析4°C和25°C储存9天的小菠菜酚类化合物变化及抗氧化活性，发现低温储存能有效保持总酚（TPC）和总黄酮（TFC）含量及抗氧化活性，而高温储存导致显著降解，主要贡献者包括甜菜碱、芦丁、p-香豆酸等，揭示了储存条件对功能成分的影响机制。

　　这项研究聚焦于婴儿菠菜在不同储存条件下的生物活性成分变化，特别是其酚类化合物的稳定性。婴儿菠菜作为一种富含多种生物活性物质的绿叶蔬菜，其营养价值和健康效益得到了广泛认可。然而，储存条件对这些生物活性物质的影响尚未得到充分研究。因此，本研究通过液相色谱-电喷雾电离-四极杆时间飞行质谱（LC-ESI-QTOF-MS/MS）结合化学计量学分析，对婴儿菠菜在4°C和25°C条件下储存九天期间的酚类化合物组成变化进行了系统性分析。这种研究方法不仅能够提供更全面的化合物层面信息，还能揭示不同储存条件下酚类化合物的降解机制，为优化储存策略提供科学依据。

### 1. 婴儿菠菜的营养价值与生物活性成分

婴儿菠菜是绿叶蔬菜中的一种，因其富含多种生物活性成分，如酚类化合物和类胡萝卜素（如叶黄素、玉米黄质和β-胡萝卜素）而被认为是一种功能食品。这些生物活性成分已被证实具有抗癌、抗菌、抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗肥胖等多种健康益处。因此，理解储存对这些成分的影响对于食品工业和消费者健康至关重要。储存条件的变化，尤其是温度，可能会影响这些化合物的浓度和活性，进而影响菠菜的营养价值和功能特性。

在食品生产和消费过程中，食品浪费是一个全球性问题，每年约有10.5亿吨食品被浪费。其中，新鲜农产品，包括婴儿菠菜，因储存不当而产生大量损失。因此，研究储存条件对婴儿菠菜中生物活性成分的影响，有助于减少浪费并提高其健康价值。储存过程中，由于酶促氧化、细胞衰老和微生物降解等因素，婴儿菠菜中的酚类化合物可能会发生降解，从而影响其抗氧化能力。

### 2. 研究方法与实验设计

为了系统分析婴儿菠菜在不同储存条件下的酚类化合物变化，本研究采用了高分辨率的LC-ESI-QTOF-MS/MS代谢组学方法，结合化学计量学分析。实验中，婴儿菠菜（Mykonos和SV2157两个品种）被收集后，分别在4°C和25°C条件下储存2至9天。实验采用两组生物重复和三组技术重复，以确保结果的可靠性。新鲜和储存后的菠菜样本被切碎、冷冻干燥至少72小时，然后使用高纯度乙醇和甲醇进行提取。

在酚类化合物的定量分析中，研究团队利用Folin-Ciocalteu试剂法测量总酚含量（TPC），并使用铝氯化物法测定总黄酮含量（TFC）。同时，通过DPPH自由基清除能力和铁离子螯合能力（FICA）评估婴儿菠菜的抗氧化潜力。这些方法能够提供关于酚类化合物浓度及其生物活性变化的全面信息。

此外，LC-ESI-QTOF-MS/MS技术用于鉴定和量化婴儿菠菜中的具体酚类化合物。该技术具有高灵敏度和高分辨率，能够检测并区分多种酚类物质，包括酚酸、黄酮类化合物、木脂素、香豆素、萜类化合物等。通过与之前发表的代谢物数据库进行比对，研究团队对这些化合物进行了初步鉴定，并利用化学计量学方法（如热图聚类和相关性分析）对储存过程中代谢物的变化进行深入解析。

### 3. 储存条件对婴儿菠菜酚类化合物的影响

研究结果显示，储存温度对婴儿菠菜中酚类化合物的稳定性有显著影响。在4°C条件下储存的婴儿菠菜，其总酚含量和总黄酮含量变化较小，而25°C条件下的储存则导致这些成分的显著下降。具体而言，在4°C储存9天后，总酚含量从5.56 mg GAE/g（新鲜菠菜）降至5.12 mg GAE/g，仅下降7.9%。而在25°C储存9天后，总酚含量下降至2.51 mg GAE/g，降幅达52.7%。总黄酮含量的变化趋势类似：4°C储存9天后，总黄酮含量从1.42 mg QE/g降至1.32 mg QE/g，降幅为7.1%；而25°C储存9天后，总黄酮含量降至0.49 mg QE/g，降幅高达65.6%。

这些变化在抗氧化能力方面也得到了体现。在4°C储存的婴儿菠菜中，DPPH自由基清除能力（以Trolox当量表示）在9天内仅下降了约4.2%（从3.49 mg TE/g降至3.31 mg TE/g），而25°C储存的婴儿菠菜中，DPPH清除能力下降了约45.6%（从3.49 mg TE/g降至1.69 mg TE/g）。同样，铁离子螯合能力（以EDTA当量表示）在4°C储存的婴儿菠菜中下降了约2.9%（从529.7 μg EDTA/g降至513.4 μg EDTA/g），而在25°C储存的婴儿菠菜中，铁离子螯合能力下降了约66.2%（从529.7 μg EDTA/g降至182.5 μg EDTA/g）。

这些结果表明，低温储存（4°C）能够有效减缓婴儿菠菜中酚类化合物的降解，从而保留其抗氧化活性。相比之下，高温储存（25°C）会导致酚类化合物的快速降解，尤其是在储存超过四天后，降解率显著上升。这可能是由于高温促进了酶促氧化反应，增加了自由基的生成，同时加速了微生物的繁殖，从而加快了酚类化合物的降解过程。

### 4. 酚类化合物的降解机制与代谢变化

在LC-ESI-QTOF-MS/MS分析中，研究团队鉴定了117种代谢物，其中23种被半定量分析。这些代谢物包括多种酚酸、黄酮类化合物、木脂素、香豆素、萜类化合物等。其中，一些主要的代谢物被识别为婴儿菠菜生物活性潜力的关键成分，如甜菜碱、5,4′-二羟基-3,3′-二甲氧基-6,7-亚甲二氧基黄酮4′-葡萄糖苷、patuletin 3-(2′′-apiosylgentiobioside)、芦丁和对香豆酸。这些化合物在储存过程中表现出不同的稳定性，部分在低温条件下保持较高浓度，而另一些则在高温储存中迅速降解。

例如，对香豆酸在4°C储存条件下表现出相对稳定的趋势，仅在储存后期略有下降。而在25°C储存条件下，其浓度显著减少，表明高温可能促进了对香豆酸的降解。此外，苯甲酸在4°C储存条件下在储存四天和六天后浓度有所增加，这可能与黄酮类化合物的降解有关，因为黄酮类化合物在储存过程中可能分解为更简单的酚酸，如对香豆酸和苯甲酸。这一现象得到了相关研究的支持，表明在低温储存条件下，黄酮类化合物可能分解为更简单的酚酸，从而维持一定的抗氧化活性。

其他黄酮类化合物，如芦丁、5,3′,4′-三羟基-3-甲氧基-6,7-亚甲二氧基黄酮4′-O-葡萄糖苷、jaceidin 4′-O-葡萄糖苷、槲皮素和spinacetin等，在4°C储存条件下表现出相对较高的稳定性。这些化合物的浓度在储存过程中仅略有下降，表明它们在低温环境下具有较好的保留能力。然而，在25°C储存条件下，这些化合物的浓度显著降低，尤其是在储存六天和九天后，说明高温储存对黄酮类化合物的降解具有更大的影响。

此外，研究还发现，在储存过程中，一些酚类化合物的浓度变化与储存时间和温度密切相关。例如，某些代谢物在储存初期变化较小，但在储存四天或更长时间后，其浓度迅速下降。这可能与储存时间的延长和温度的升高共同作用有关，导致酶促反应和氧化反应的加速。为了进一步揭示这些变化的机制，研究团队进行了化学计量学分析，包括热图聚类和相关性分析，以评估储存过程中代谢物的变化趋势及其与抗氧化活性的关系。

### 5. 化学计量学分析与储存策略优化

化学计量学分析显示，储存时间与温度对婴儿菠菜中代谢物的组成和抗氧化活性有显著影响。热图分析表明，储存四天和九天的样品在25°C条件下表现出不同的代谢物组成，而4°C储存的样品在不同储存时间点之间变化较小。这说明，4°C储存条件能够有效维持婴儿菠菜中代谢物的稳定性，而25°C储存则会导致代谢物的显著降解。

在生物信息学分析中，研究团队发现，某些代谢物在储存过程中表现出较高的相关性。例如，总黄酮含量与DPPH和FICA测定值之间存在高度正相关，表明黄酮类化合物是婴儿菠菜抗氧化活性的主要贡献者。同时，一些非酚类代谢物，如甜菜碱，也表现出较高的稳定性，这可能与其结构和储存环境有关。

通过这些分析，研究团队进一步揭示了储存过程中婴儿菠菜代谢物的变化趋势。例如，储存四天和九天的样品在25°C条件下表现出更明显的代谢物降解，而4°C储存的样品则显示出更稳定的代谢物组成。这表明，低温储存不仅能够延缓酚类化合物的降解，还能维持其抗氧化活性，从而提高婴儿菠菜的营养价值和健康效益。

### 6. 研究意义与未来展望

本研究的结果对于食品工业和消费者健康具有重要意义。首先，它揭示了储存条件对婴儿菠菜中生物活性成分的影响，为优化储存策略提供了科学依据。其次，它提供了婴儿菠菜中酚类化合物的详细代谢图谱，有助于理解这些化合物在储存过程中的变化机制。最后，它强调了低温储存的重要性，特别是在延长婴儿菠菜货架期和保留其健康价值方面。

未来的研究可以进一步探讨微生物降解和酶促氧化对婴儿菠菜中酚类化合物稳定性的影响，以及开发能够实时监测储存过程中代谢物变化的传感器技术。这些研究不仅有助于提高婴儿菠菜的储存效率，还能为其他绿叶蔬菜的储存研究提供参考。此外，进一步研究不同储存条件对婴儿菠菜中其他生物活性成分（如类胡萝卜素）的影响，也有助于全面评估其营养价值和健康效益。

总之，本研究通过高分辨率代谢组学方法，揭示了储存条件对婴儿菠菜中酚类化合物的影响，为食品工业和消费者提供了重要的科学依据，有助于减少食品浪费并提高婴儿菠菜的健康价值。