代谢和功能分析揭示了在胃肠道挑战条件下Saccharomyces boulardii中的抗逆网络

《LWT》：Metabolic and functional analyses reveal the stress tolerance network in Saccharomyces boulardii during gastrointestinal challenge

　　胃肠道压力下酵母菌代谢适应性研究揭示有机酸、脂类及杂环化合物主导代谢响应，肠道液体压力诱导最显著变化（1029代谢物差异），关键富集于嘌呤/嘧啶代谢及氨基酸糖苷代谢，并发现巴黎万尼苷A等应激相关代谢物。

　　本研究围绕益生菌酵母 *Saccharomyces boulardii* 在模拟胃肠道环境中的代谢适应机制展开，旨在揭示其在面对胃酸、肠液以及连续胃-肠环境压力时的生存策略。作为一类在人类和动物体内发挥有益作用的微生物，益生菌的存活能力直接决定了其在肠道中的有效性和应用潜力。*S. boulardii* 以其卓越的耐受性而著称，尤其在应对胃肠道中的强酸性环境、胆盐和消化酶等挑战时表现出色。然而，尽管已有大量研究关注其生存能力，其具体的代谢调控机制仍不完全明确。因此，本研究采用基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的代谢组学方法，对 *S. boulardii* 在不同胃肠道压力条件下的代谢响应进行系统分析，以期为优化其益生功能提供理论依据。

在实验设计中，研究人员首先对 *S. boulardii* CNCM I-745 进行了预培养，随后模拟了胃肠道的两种主要环境：胃酸环境和肠液环境。通过连续暴露于这两种环境，研究人员观察到了该酵母细胞在不同压力下的代谢变化。实验过程中，微生物样本在每个压力阶段后均被离心、洗涤并保存以供后续分析。为了全面评估代谢变化，样本被分为四组：无压力组、仅胃酸压力组、仅肠液压力组以及连续胃-肠压力组。通过这种分组方式，研究人员能够更清晰地对比不同压力条件下的代谢差异，并进一步探讨这些差异背后的生物学意义。

在代谢物提取方面，实验采用了严格的步骤以确保数据的准确性和可靠性。首先，样本被解冻至室温，随后加入含甲醇的 L-2-氯苯丙氨酸溶液作为内标物，进行短暂的涡旋混合。接着，使用冷甲醇与乙腈的混合液对蛋白质进行沉淀，并通过涡旋和超声辅助提取，进一步分离出细胞内的代谢物。提取后的样本在低温下离心，上清液经真空浓缩后，重新溶解于甲醇-水混合液中，再次离心后，上清液通过 0.22 微米膜过滤，最终保存于 -80°C 以备分析。这种提取方法不仅保证了代谢物的完整性，也提高了检测的准确性，为后续的代谢组学分析奠定了基础。

在代谢物的检测与分析过程中，实验采用了超高效液相色谱-高分辨率质谱联用技术（UPLC-HRMS）。该技术结合了高效分离能力和高精度质谱检测，能够对复杂的代谢物谱进行深入解析。通过该方法，研究人员获取了高质量的代谢物数据，并利用多种统计分析工具进行处理。其中包括 Progenesis QI 软件，该软件通过光谱解卷积、峰识别和保留时间对齐等步骤，对原始数据进行了全面处理。此外，实验还对代谢物的相对丰度进行了标准化，以确保不同样本之间的可比性。在数据库匹配方面，研究人员利用了多种权威数据库，如 *S. cerevisiae*（酵母）数据库、人类代谢组数据库（HMDB）、Lipidmaps、METLIN 和 LuMet-Animal 本地数据库，这些数据库提供了丰富的代谢物信息，有助于准确识别和分类实验中的代谢物。

数据分析结果显示，*S. boulardii* 在面对不同压力条件时，其代谢物谱发生了显著变化。在所有实验组中，有机酸及其衍生物、脂类及脂样分子、有机杂环化合物构成了主要的代谢物类别。其中，有机酸和氨基酸是最为丰富的子类别。通过主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等多变量统计方法，研究人员发现四个实验组之间存在明显的代谢差异。生物重复样本的紧密聚类表明实验结果具有良好的可重复性，为后续的代谢物分析提供了可靠的基础。

进一步的分析表明，肠液压力条件对 *S. boulardii* 的代谢影响最为显著，共有 2,029 种代谢物发生了变化，其中 1,008 种代谢物上调，1,021 种代谢物下调。相比之下，胃酸压力条件下的代谢变化相对较少。这种差异可能与肠液中含有的高浓度胆盐和胰酶有关，这些物质对细胞膜和细胞壁的破坏作用更为强烈。KEGG 路径富集分析进一步揭示了在不同压力条件下，*S. boulardii* 的代谢网络发生了显著重组。例如，在连续胃-肠压力条件下，嘌呤/嘧啶代谢和氨基酸糖/核苷酸糖代谢等通路被显著激活，这些通路对于细胞的能量平衡和细胞壁维持至关重要。而酪氨酸代谢和牛磺酸代谢等通路则被抑制，这可能反映了酵母在压力环境下对资源的重新分配，以确保核心生存功能的优先执行。

此外，通过相关性分析，研究人员识别了若干关键的代谢物，这些代谢物在压力条件下表现出显著的上调或下调趋势。例如，Parisvanioside A 和甘油磷脂（glyceryl phosphatide）在肠液压力下被显著上调，而Valorphin 和D-葡萄糖胺则被显著下调。这些代谢物的变化可能反映了酵母在应对不同压力时的特定适应策略。Parisvanioside A 作为一种糖苷化合物，可能在维持细胞膜稳定性、防止渗透压失衡方面发挥重要作用。而甘油磷脂则可能通过调节膜脂质组成，帮助酵母细胞在面对胆盐等环境压力时保持膜功能。Valorphin 的减少可能意味着酵母在压力环境下优先分配氨基酸资源用于抗氧化和蛋白质保护功能，而不是合成非必需的次级代谢物。这些发现不仅揭示了 *S. boulardii* 的代谢灵活性，也为理解其在胃肠道中的生存机制提供了新的视角。

值得注意的是，研究还发现了一些代谢物在所有四个比较组中均表现出显著变化，这表明这些代谢物可能在 *S. boulardii* 的胃肠道耐受性中起着核心作用。例如，PS（14:0/0:0）和CDP-DG（1-2:0/18:1-O）在所有组别中均被上调，这可能与其在细胞膜结构稳定性和能量代谢中的作用有关。同时，还有 13 种代谢物在胃酸和肠液压力组中均被显著改变，这些代谢物可能在应对不同压力时具有协同作用。例如，PA（17:0/15:1）和某些有机酸可能通过调节细胞内的渗透压和膜流动性，帮助酵母在胃肠道环境中维持生存。

本研究的发现具有重要的理论和应用价值。首先，它揭示了 *S. boulardii* 在面对胃肠道压力时，其代谢网络会发生动态调整，以确保细胞的生存和功能。这种调整不仅包括对特定代谢通路的激活，还涉及对其他通路的抑制，从而实现资源的优化配置。其次，研究结果表明，肠液压力条件对酵母的代谢影响最为显著，这提示我们，肠道环境中的胆盐和胰酶可能是决定益生菌存活的关键因素。因此，在设计益生菌制剂时，应特别关注这些环境因素，并通过优化配方来增强其在肠道中的存活能力。此外，研究还指出了某些代谢物可能在增强益生菌耐受性方面具有潜在作用，这些代谢物的调控可能成为未来益生菌工程研究的重要方向。

然而，本研究也存在一定的局限性。首先，尽管实验采用的是模拟胃肠道环境，但这种体外模型可能无法完全反映体内复杂的生理和生化条件，包括宿主与微生物之间的相互作用以及肠道中的持续流动状态。因此，未来的研究应考虑在体内环境下进行更全面的评估，以提高实验结果的临床相关性。其次，尽管高分辨率 LC-MS/MS 技术能够提供高精度的代谢物检测，但其对整个代谢组的覆盖仍存在一定的局限性，某些新型或罕见代谢物的鉴定可能依赖于数据库匹配，这可能带来一定的误判风险。此外，实验采用的非靶向代谢组学方法在检测和定量某些代谢物类别（如高度挥发性或易降解的代谢物）时可能存在偏差。最后，本研究仅针对 *S. boulardii* 单一菌株，其代谢适应机制是否适用于其他菌株或物种仍有待进一步验证。

综上所述，本研究通过系统分析 *S. boulardii* 在模拟胃肠道压力下的代谢响应，揭示了其在应对不同环境挑战时的代谢适应策略。研究发现，肠液压力条件对酵母的代谢影响最为显著，而某些关键代谢物如 Parisvanioside A 和甘油磷脂可能在维持细胞稳定性方面发挥重要作用。同时，Valorphin 和D-葡萄糖胺的减少反映了酵母在压力环境下对资源的优先分配。这些发现不仅有助于深入理解 *S. boulardii* 的生存机制，也为优化其益生功能提供了新的思路。未来的研究应进一步探索这些代谢物的具体功能，并结合体内实验验证其在实际应用中的效果，从而推动益生菌在肠道健康领域的应用和发展。