基于HCR/DNAzyme的级联信号放大荧光适配体传感器，用于检测食品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇

《Talanta》：HCR/DNAzyme Driven Cascade Signal Amplified Fluorescent Aptasensor for Detecting Deoxynivalenol in Food

　　本研究开发了一种基于HCR与DNAzyme级联放大的荧光aptasensor，用于食品中痕量DON检测。通过自持反馈循环机制实现信号放大，检测限低至0.3092 pg/mL，线性范围1-100 ng/mL，特异性、稳定性及加标回收率均表现优异，验证了方法的高效性与可靠性。

　　本研究聚焦于一种广泛存在的霉菌毒素——脱氧雪腐碱烯醇（Deoxynivalenol, DON）的检测问题。DON是由镰刀菌属中的某些菌种，如禾谷镰刀菌（*Fusarium graminearum*）和尖孢镰刀菌（*Fusarium culmorum*）产生的，属于三烯类毒素中的B型[1]。作为一种常见的霉菌毒素污染物，DON广泛存在于全球的谷物作物中，如小麦、玉米和大米及其加工产品中。此外，它也可能通过受污染的饲料进入动物源性食品，如肉类、蛋类和乳制品，从而对人类健康构成威胁[3]。研究表明，DON具有显著的健康风险，即使在低剂量暴露下，也可能会引发免疫毒性、发育毒性和生殖毒性[4]。动物实验表明，当DON浓度达到25 μg/mL时，大鼠和小鼠的肝细胞样本会出现不同程度的损伤[5]。由于其稳定的化学性质，DON能够抵抗大多数传统食品加工和烹饪过程，并在食品链中保持不变，因此成为食品安全和公共卫生领域中的长期挑战[2]。欧盟还将其归类为“第三类致癌物”[6]。面对日益严格的监管要求，开发快速、灵敏且可靠的分析技术以检测DON的痕量和超痕量残留显得尤为迫切。

目前，DON的常规分析主要依赖于两种技术：仪器分析和免疫分析。仪器分析方法，如高效液相色谱（HPLC）[8]、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[9]和薄层色谱（TLC）[10]等，因其高精度和准确性而受到认可。然而，这些方法均依赖精密仪器，操作过程较为复杂，缺乏便携性，这限制了它们在快速现场筛查中的应用。免疫分析方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）[11]和侧向流动免疫分析（LFIA）[12]，虽然操作简便，但也存在一些局限，例如核心抗体的生产成本高、生产周期长、批次间差异大，以及在复杂样品基质中容易产生假阳性结果[13]。因此，迫切需要建立一种替代方法，该方法能够结合高灵敏度、强特异性、简便操作和低成本的特点。在此背景下，生物传感器成为极具前景的解决方案，其核心功能是高度选择性地识别目标分析物[14]，[15]。传统的生物传感器通常采用抗体作为分子识别元件，但抗体的生产本质上依赖于动物免疫，这一过程不仅成本高、耗时长，而且在规模化生产及批次间一致性方面也面临挑战[16]，[17]，[18]。相比之下，核酸适配体具有独特的优势。适配体是通过“指数富集的配体系统进化（SELEX）”技术从大量随机序列库中筛选得到的短单链RNA或DNA寡核苷酸。它们具有结构灵活、合成成本低、开发周期短、易于大规模化学合成等优点[19]，[20]。同时，它们也表现出更高的稳定性和更长的保质期。自1990年被引入以来，适配体已被广泛用作识别元件，用于开发多种生物传感平台。其中，荧光适配体传感器因其快速响应和易于操作的特点，完美结合了适配体的特异性与荧光检测的灵敏度，被广泛应用于医学诊断[21]，[22]，[23]、环境监测[24]，[25]，[26]和食品安全[27]，[28]等领域。这些传感器是超灵敏检测平台的前沿技术[29]。将适配体作为识别元件与荧光检测作为信号转导方式相结合，荧光适配体传感器为靶标检测提供了强大的平台[30]。在生物学领域，大多数生物分子本身无法发出荧光，因此荧光标记成为定量检测目标物质的有效方法[31]。其中，弗斯特共振能量转移（FRET）是一种高效的标记策略，其在检测复杂基质如食品样品中的痕量目标时表现出显著的响应性和特异性。近年来，尽管为DON开发的各种荧光传感器表现出优异的性能[32]，[33]，但由于食品基质的复杂性，这些方法仍难以满足对超痕量DON残留的检测需求。

为应对检测痕量毒素的迫切需求，研究界越来越关注信号放大策略。目前，许多酶免信号放大技术已被开发，用于增强检测信号，包括杂交链反应（HCR）[34]、催化发夹组装（CHA）[35]、链置换扩增（SDA）[36]和滚环扩增（RCA）[37]，[38]，[39]。这些方法因其在简单性、稳定性和成本效益方面的明显优势而受到广泛关注。通过有效降低背景噪声，它们可以显著增强灵敏传感器的信号输出。在各种酶免放大方法中，HCR因其设计简单和稳定性强而备受青睐。然而，传统的HCR是一个线性放大过程，这在本质上限制了其信号增益。近年来，一种更强大的“反馈放大”策略引起了广泛关注。作为一种具有高催化活性的特定DNA序列，DNAzyme相比蛋白质酶具有明显优势，如高效性和低成本，使其成为酶免放大技术中的关键组成部分[40]，[41]。值得注意的是，将HCR与具有切割活性的DNAzyme结合，可以构建一个高效的级联放大系统，从而为实现超灵敏检测提供了一种新颖且有前景的方法[42]。

受此启发，我们开发了一种结合HCR与DNAzyme触发扩增的级联信号放大荧光适配体传感器，用于食品中DON的超灵敏检测。该传感器的核心创新在于其“一次触发，多次循环”的放大机制：DON毒素与适配体的初始结合会释放触发链（cDNA），从而启动四个DNA发夹（H1-H4）之间的HCR扩增反应。在此过程中，产生的DNAzyme会切割其特异性底物，生成含有完整cDNA序列的片段。这些片段重新启动HCR，形成一个自我维持的反馈环，从而驱动连续的级联放大。这种“一次输入，多次使用”的模式可以实现指数级信号增强，显著降低检测限（LOD）并提高整体灵敏度。此外，该传感器中的HCR元件和可切割底物均采用了刚性的二维DNA发夹结构。在没有目标物质的情况下，适配体会将cDNA包裹起来，使得H3发夹保持稳定闭合状态。此时，6-羧基荧光素（6-FAM）与黑孔淬灭剂-1（BHQ-1）之间的距离非常近，从而产生荧光淬灭，实现极低的背景信号。这种设计确保了高结合效率和出色的抗干扰能力。在本研究中，我们成功构建了这种基于HCR/DNAzyme触发的级联放大荧光适配体传感器，用于痕量DON的检测。我们详细阐述了其设计原理，系统评估了其分析性能（包括灵敏度、特异性、稳定性和可重复性），并通过在复杂食品基质中的加标回收实验验证了其实际应用价值。

该研究提出了一种创新的信号放大策略，将HCR与DNAzyme的级联放大相结合，显著提高了DON检测的灵敏度和准确性。通过这种策略，检测限被降低至0.3092 pg/mL，检测范围扩大至1 pg/mL至100 ng/mL，且R2值达到0.9952，表明其线性关系良好。同时，该传感器在稳定性、可重复性和特异性方面表现出色。加标回收实验的结果（89.4%-102.5%）与同位素稀释液相色谱-串联质谱（ID-LC-MS/MS）参考方法（81.7%-104%）非常接近，进一步验证了其准确性和可靠性。这一成果不仅为DON的痕量检测提供了强大的工具，还为高性能生物传感平台的开发提出了新的设计策略。

本研究的成果在多个方面具有重要意义。首先，它为食品安全领域提供了一种快速、灵敏和可靠的检测方法，能够有效应对食品基质复杂性带来的检测挑战。其次，该方法具有良好的可重复性和稳定性，适合用于现场检测和大规模应用。此外，该传感器的设计策略具有高度的可扩展性，可以为其他痕量毒素的检测提供参考。最后，该研究展示了将HCR与DNAzyme结合的级联放大机制在生物传感中的应用潜力，为未来开发更高效的检测技术奠定了基础。

从实际应用角度来看，该荧光适配体传感器具有广泛的适用前景。它可以用于食品加工和流通环节中的DON快速筛查，为监管部门提供科学依据。此外，该传感器还可以用于农业生产和储存环节，帮助识别受污染的谷物产品，从而保障食品安全。在医疗领域，该传感器也可用于检测DON对人类健康的影响，为疾病诊断和预防提供支持。同时，该技术的可扩展性使得其有望应用于其他食品安全相关的检测任务，如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等的检测。在环境监测方面，该传感器也可以用于检测水体或土壤中的DON残留，为环境治理提供数据支持。总之，该研究不仅在DON检测方面取得了突破，也为其他生物分子的检测提供了新的思路和方法。

本研究的创新点在于其独特的“一次触发，多次循环”反馈机制。该机制通过DON与适配体的结合触发HCR反应，同时引导DNAzyme的生成和切割过程，从而实现信号的连续级联放大。这种机制不仅提高了检测的灵敏度，还增强了检测的稳定性。此外，该传感器的设计采用了刚性的二维DNA发夹结构，有效降低了背景信号，提高了检测的准确性。这种设计策略为未来开发其他高灵敏度生物传感器提供了参考。在实际操作中，该传感器具有简便的操作流程，适合用于现场检测。同时，其成本效益高，有助于推动其在实际应用中的普及。

在实验设计和实施过程中，我们采用了多种方法对传感器的性能进行系统评估。首先，通过加标回收实验验证了其在复杂食品基质中的检测能力。其次，通过检测不同浓度DON的响应情况，评估了其线性范围和检测限。此外，还通过比较不同检测方法的结果，验证了其准确性。这些实验不仅证明了该传感器的性能优势，还为其实用性提供了有力支持。同时，该传感器的稳定性和可重复性也得到了验证，表明其在实际应用中具有良好的适应性。

本研究的成果不仅具有理论意义，也具有重要的实际应用价值。它为食品安全检测提供了一种新的工具，有助于提高检测效率和准确性。此外，该方法还可以用于环境监测和医疗诊断，为相关领域的研究提供支持。在食品安全监管方面，该传感器可以作为快速筛查工具，帮助监管部门及时发现受污染的食品，从而采取相应的措施。在农业生产和储存环节，该传感器可以帮助识别受污染的谷物产品，为食品安全提供保障。在医疗领域，该传感器可以用于检测DON对人类健康的影响，为疾病诊断和预防提供支持。在环境监测方面，该传感器可以用于检测水体或土壤中的DON残留，为环境治理提供数据支持。

此外，该研究还为高性能生物传感平台的开发提供了新的设计策略。通过将HCR与DNAzyme的级联放大机制相结合，该传感器实现了信号的连续增强，显著提高了检测的灵敏度。这种设计策略可以为其他生物分子的检测提供参考，例如其他霉菌毒素、重金属离子、药物残留等。同时，该方法还可以用于开发其他类型的生物传感器，如电化学传感器、电化学发光传感器等，从而拓展其应用范围。这种跨学科的创新方法不仅提高了检测技术的水平，还推动了生物传感领域的技术进步。

在研究过程中，我们还对适配体的筛选和优化进行了深入探讨。适配体的筛选是通过SELEX技术完成的，该技术能够从大量随机序列中筛选出具有高亲和力和特异性的适配体。适配体的优化则通过调整其序列和结构，使其在复杂基质中仍能保持高灵敏度和特异性。这种优化策略为未来开发其他高灵敏度生物传感器提供了参考。同时，适配体的结构优化也提高了其在实际应用中的稳定性，使其能够适应不同的检测环境。

该研究的成果还具有重要的科学价值。它不仅推动了生物传感技术的发展，还为食品安全检测提供了新的思路。通过将HCR与DNAzyme的级联放大机制相结合，该传感器实现了信号的连续增强，显著提高了检测的灵敏度。这种机制的建立为未来开发更高效的检测技术奠定了基础。同时，该研究还展示了适配体在生物传感中的广泛应用前景，为相关领域的研究提供了支持。

在实验过程中，我们还对传感器的信号转导机制进行了详细研究。荧光适配体传感器的信号转导依赖于FRET技术，该技术能够通过荧光分子之间的能量转移实现信号的增强。在没有目标物质的情况下，适配体会将cDNA包裹起来，使得H3发夹保持闭合状态，从而实现荧光淬灭。当目标物质存在时，适配体会释放cDNA，启动HCR反应，从而实现信号的增强。这种信号转导机制不仅提高了检测的灵敏度，还增强了检测的特异性。

此外，该研究还对传感器的抗干扰能力进行了评估。在复杂食品基质中，其他物质可能会干扰DON的检测。通过采用刚性的二维DNA发夹结构，该传感器有效降低了背景信号，提高了检测的准确性。这种设计策略为未来开发其他高灵敏度生物传感器提供了参考。同时，该方法还可以用于开发其他类型的生物传感器，如电化学传感器、电化学发光传感器等，从而拓展其应用范围。

综上所述，本研究通过创新性的信号放大策略，成功开发了一种高灵敏度的荧光适配体传感器，用于食品中DON的检测。该传感器不仅在检测性能上表现出色，还在实际应用中具有良好的适应性。它的成果为食品安全检测提供了新的工具，同时也为高性能生物传感平台的开发提出了新的设计策略。未来，该技术有望在更多领域得到应用，如医疗诊断、环境监测和食品安全监管，为相关领域的研究和实践提供支持。