CRISPR/Cas12a与外切核酸酶III辅助的级联循环扩增技术的结合，用于实现对环丙沙星的超高灵敏度电化学检测

《Talanta》：Cooperation of CRISPR/Cas12a and exonuclease III-assisted cascade cycling amplification for ultrasensitive electrochemical detection of ciprofloxacin

　　基于CRISPR/Cas12a与Exo III辅助循环扩增的高灵敏度电化学生物传感器开发及对环丙沙星检测的应用 CRISPR/Cas12a与Exo III协同实现环丙沙星（CIP）的高灵敏度检测，通过CIP诱导探针构象变化启动Exo III循环扩增DNA，增强CRISPR/Cas12a转切裂活性，显著提升电化学信号，检测限达0.022 ng/mL，系统无需复杂探针标记且稳定性优异，适用于食品安全监测。

　　抗生素残留一直是全球公共健康领域的重要问题。由于其对环境和人类健康的潜在危害，开发一种敏感且可靠的检测方法对于控制抗生素污染、确保食品安全以及保护人类健康具有重要意义。本文提出了一种基于CRISPR/Cas12a和Exo III辅助级联循环扩增技术的超灵敏电化学生物传感器，用于检测环丙沙星（CIP）残留。该方法通过DNA探针的构象变化触发Exo III的级联循环扩增，从而产生大量DNA片段作为目标链，激活CRISPR/Cas12a的跨裂解活性。激活后的CRISPR/Cas12a迅速裂解电极表面的信号探针，导致显著的电化学信号变化，最终实现对CIP的超灵敏检测。这种方法不仅提高了检测的灵敏度，还具备良好的特异性、精确性和稳定性，为食品安全监测提供了有力支持。

环丙沙星是一种合成喹诺酮类抗生素，因其强大的广谱抗菌活性，在畜牧业和家禽养殖过程中被广泛使用，以预防和治疗感染性疾病。然而，抗生素的滥用或误用会导致其在环境中过量存在，并污染食品。最终，这些过量的抗生素可能通过食物链进入人体，引发急性或慢性毒性，甚至导致细菌耐药性的产生。因此，对食品中环丙沙星残留进行敏感和有效的监测具有重要意义。当前，多种传统分析方法已被用于检测环丙沙星，主要包括表面增强拉曼光谱、高效液相色谱、毛细管电泳以及免疫分析等方法。尽管这些方法在检测效果和灵敏度方面表现出色，但它们通常需要复杂的样品预处理、专业操作人员和昂贵的仪器设备，限制了其在实际应用中的便捷性和普及性。

相比之下，电化学生物传感器因其成本低廉、操作简便以及高灵敏度、快速响应和良好的重现性等优势，被认为是检测抗生素残留的一种有前景的方法。此外，电化学生物传感器通常采用适配体作为生物识别元件，这些适配体具有优异的选择性和结合亲和力，能够高效识别目标分子。同时，适配体的易得性和可编程性也使得电化学生物传感器在设计上更加灵活。进一步地，无需标记探针的电化学生物传感器能够实现简单的传感器构建，降低成本，并提高稳定性，因此在痕量物质检测方面展现出巨大潜力。

为了进一步提升电化学生物传感器的灵敏度，许多研究者将核酸信号放大策略引入其中。在各种核酸放大策略中，酶辅助的核酸放大方法因其高效性和操作简便性而受到广泛关注。特别是，Exo III（外切酶III）因其出色的催化效率和稳定的切割活性，在构建酶辅助核酸放大系统中发挥了重要作用。Exo III能够特异性地切割双链DNA的平末端或凹陷的3′末端，从而释放和回收单链DNA，实现级联信号放大。这种方法不需要复杂的序列设计，能够显著增强信号并减少背景噪声，为高灵敏度检测提供了新的思路。

近年来，CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）及其相关Cas蛋白系统因其在基因调控和基因编辑方面的强大能力，被广泛应用于生物传感器的开发。CRISPR/Cas12a作为Cas蛋白家族中的一个代表，不仅能够对目标双链DNA进行cis-裂解，还具有跨裂解活性，即能够裂解与目标DNA相邻的非特异性单链DNA。这种独特的跨裂解活性使得CRISPR/Cas12a在生物传感领域具有广泛的应用前景。通过提高响应性、简化操作流程和增强信号输出，CRISPR/Cas12a能够显著提升生物传感器的分析性能，为核酸和非核酸目标的检测开辟了新的途径。

随着CRISPR/Cas系统在多个领域的应用不断扩展，其自身的能力可能难以满足日益复杂和精细化的需求。因此，许多研究者尝试将核酸信号放大策略与CRISPR/Cas系统相结合，以进一步提高目标物质的检测效率和灵敏度。受这些研究的启发，我们提出了一种将Exo III辅助的核酸级联循环扩增策略引入CRISPR/Cas12a系统的新型检测平台。该平台通过Exo III的高效循环扩增和CRISPR/Cas12a的跨裂解活性，实现了对环丙沙星残留的超灵敏检测。

在该方法中，环丙沙星的存在会引发DNA探针的构象变化，从而启动Exo III的级联循环扩增过程。这一过程能够生成大量DNA片段，这些片段作为目标链进一步激活CRISPR/Cas12a的跨裂解活性。激活后的CRISPR/Cas12a迅速裂解电极表面的信号探针，导致电化学信号的显著变化，最终实现对环丙沙星的高效检测。通过结合Exo III的卓越循环扩增能力和CRISPR/Cas12a的高灵敏度跨裂解活性，该方法显著提升了生物传感器的分析性能。

此外，该检测系统具备良好的放大能力、高特异性和可编程性，使其在复杂环境中的检测表现出色。同时，该方法无需复杂的核酸序列设计、标记探针和繁琐的实验操作，因此具有操作简便、成本低廉的优势。这些特点使得该电化学生物传感器在实际食品样本检测中具有较高的应用价值和可行性，为食品安全监测提供了一种可靠的技术手段。

为了实现这一目标，我们对金电极进行了预处理和修饰。首先，使用piranha溶液（H?SO?与30% H?O?按体积比3:1混合）对金电极表面进行清洗，以去除氧化物和颗粒杂质。随后，依次用0.3 μm和1.0 μm的氧化铝进行抛光，确保电极表面的平整和清洁。清洗完成后，电极在乙醇和超纯水中进行超声波清洗，以进一步去除残留物质。这些预处理步骤为后续的生物传感器构建奠定了良好的基础，确保了电极的稳定性和重现性。

在检测原理方面，该方法通过一个精心设计的信号放大机制来实现对环丙沙星的高效检测。具体而言，我们采用了一种高亲和力的适配体（Kd = 0.11 nM），该适配体通过Capture-SELEX方法筛选得到，作为环丙沙星的识别探针。当环丙沙星存在时，它会与适配体结合，从而竞争性地阻止适配体与互补DNA链（DNA1）的杂交。这种竞争性结合导致DNA1的释放，为后续的级联循环扩增提供了条件。释放的DNA1随后被Exo III催化，通过一系列的切割和重组反应，产生大量DNA片段。这些DNA片段作为目标链，进一步激活CRISPR/Cas12a的跨裂解活性，使其能够高效地裂解电极表面的信号探针，从而引发显著的电化学信号变化。

通过这一机制，我们成功实现了对环丙沙星的超灵敏检测，其检测限低至0.022 ng/mL。这一结果表明，该方法在实际应用中具有极高的灵敏度和可行性。同时，该方法的高特异性和稳定性也确保了检测结果的准确性和可靠性。此外，由于无需复杂的探针设计和标记步骤，该方法在操作上更加简便，进一步降低了检测成本，提高了其实用性。

综上所述，本文提出了一种基于CRISPR/Cas12a和Exo III辅助级联循环扩增的超灵敏电化学生物传感器，用于检测环丙沙星残留。该方法通过结合Exo III的高效循环扩增能力和CRISPR/Cas12a的跨裂解活性，实现了对目标物质的精准识别和高效检测。该检测系统不仅具有良好的特异性、精确性和稳定性，还具备操作简便、成本低廉等优势，为食品安全监测提供了一种可靠的技术手段。未来，该方法有望在更广泛的抗生素残留检测中得到应用，进一步推动食品安全领域的技术进步。