综述：蛋白酶在噬菌体防御系统中的作用及其在生物工程中的潜力

《TRENDS IN Biochemical Sciences》：Proteases in bacteriophage defense systems and their potential in bioengineering

　　这篇综述系统梳理了细菌蛋白酶防御系统（PADS）的最新研究进展，揭示了其通过蛋白酶活性（如CRISPR-Cas系统调控的Craspase、PCaspase等）直接切割蛋白质以抵御噬菌体感染的独特机制。作者强调这类可诱导、可编程的蛋白酶工具在生物工程中具有广阔前景，例如开发新型生物传感器、调控蛋白功能及细胞命运，为替代核酸编辑提供了更安全的蛋白水平编辑策略。

　　

蛋白酶活性在生命界中高度保守

蛋白酶作为能够水解肽键的关键酶类，在所有生命形式的细胞过程中扮演着核心角色。在真核生物中，蛋白酶参与维持稳态、细胞分化、迁移及高级生命过程。在免疫方面，caspase介导的细胞凋亡和炎症小体激活、补体级联中的丝氨酸蛋白酶以及泛素-蛋白酶体系统等都是典型例子。细菌中的蛋白酶同样承担着维持蛋白质稳态、降解错误折叠蛋白、调控细胞分裂、命运决定和信号转导（如毒素-抗毒素系统、群体感应）等重要功能。病毒也利用蛋白酶进行多蛋白前体成熟、病毒颗粒组装和对抗宿主免疫。这种功能的广泛保守性暗示了蛋白水解机制古老的进化起源。

细菌PADS库的涌现

随着基因组防御系统图谱绘制、蛋白质比较和聚类技术的发展，多种新型噬菌体防御机制被发掘出来，其中蛋白酶相关防御系统（PADS）作为一支新军备受关注。这些系统能感知多种触发器（如DNA损伤、噬菌体相关分子模式PhAMPs），并利用多样的酶效应器（如代谢物消耗蛋白、限制性内切酶）介导防御。

半胱氨酸蛋白酶

这类蛋白酶在PADS中尤为突出，特别是caspase家族及其进化相关物。例如，细菌中已发现caspase可通过蛋白水解切割激活gasdermin样细胞死亡效应器，类似于真核细胞的焦亡。IV型Thoeris系统利用TIR结构域感知噬菌体成分，产生N7-环状ADPR（N7-cADPR）信号分子，进而激活caspase样蛋白酶，导致细胞和潜在噬菌体蛋白的大量减少以阻止噬菌体繁殖。CRISPR调控的蛋白酶家族是另一重要代表：Craspase（III-E型CRISPR-Cas）在gRNA与靶RNA杂交后发生构象变化被激活，切割宿主蛋白Csx30，解除对转录因子RpoE的抑制，引发流产感染；PCaspase（III-B型系统）则通过第二信使cA₃激活SAVED-CHAT蛋白酶，进而激活PCaspase，广泛切割底物蛋白来实施防御。此外，DdvA-DdvS系统可能通过感知周质信号，启动蛋白酶活性和调控内膜蛋白水解（RIP）级联，释放转录因子DdvS来诱导抗病毒基因表达。单基因Borvo系统编码的CHAT蛋白酶能提供广泛的抗噬菌体保护，其机制可能涉及切割细菌gasdermin同源物或感应损伤触发休眠。

金属蛋白酶

这类蛋白酶在其活性位点结合金属离子（如Zn²⁺、Mg²⁺），协调肽键水解。多个CBASS系统采用类似真核泛素化的E1-E2酶级联反应，将系统编码的类泛素蛋白缀合到靶标上（如噬菌体尾部纤维），从而干扰病毒组装。其中的JAB金属蛋白酶（去泛素化酶DUB/JAMM样）扮演着双重角色：既 priming 类泛素蛋白用于缀合，也负责从靶标上将其移除以回收利用。其他系统如PD-λ-2、MucP（膜锌金属蛋白酶，可切割ssRNA噬菌体PP7的裂解蛋白）以及Lamassu家族成员也涉及金属蛋白酶活性。CapP金属蛋白酶则能在ssDNA存在下降解转录抑制因子CapH，从而上调同源CBASS系统表达并引发流产感染。

丝氨酸蛋白酶

ATP依赖的Lon样蛋白酶和胰蛋白酶样蛋白酶是这类代表。CalpL（与CRISPR-Cas III型相关）在cA₄激活后寡聚化，切割CalpT，暴露降解子（degron）使其被ClpX/P系统降解，从而释放σ因子CalpS启动转录应答。BREX系统含有Lon样蛋白酶结构域，其缺失会 abolishes 防御表型，单独表达则对宿主有高毒性。HamABM系统则展示了蛋白酶门控的核酸酶激活机制：胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域HamA激活核酸酶HamM的前酶形式，导致DNA降解。此外，分泌型胰蛋白酶样蛋白酶可通过促进病毒颗粒提前释放DNA来降低噬菌体感染性；毒素-抗毒素（TA）系统（如MazEF）也常受到宿主Lon样和ClpP样丝氨酸蛋白酶的调控。

扩展PADS库

生物信息学分析预测了大量潜在的PADS。研究发现了与CRISPR阵列相关的多种蛋白酶编码簇，包括天冬氨酸蛋白酶（如结构类似人DDI2蛋白酶域的icity0034簇）、跨膜金属蛋白酶（如M48家族的Ste24同源物、M78家族的ImmA样蛋白酶）、丝氨酸蛋白酶（如菱形蛋白家族成员）以及众多含有SAVED-CHAT、TPR-CHAT、Lon蛋白酶等效应器的系统（如UAS系列）。这些系统通过结构域复制、融合事件和获得新效应器活性展现出显著的多样性，但其激活机制、感知信号和底物谱仍是未来研究的重点。

蛋白酶工程与底物拓展

拓展蛋白酶底物范围可通过筛选现有可被天然切割的蛋白质/结构域，或直接对蛋白酶进行工程化改造来实现。蛋白酶工程可采用定点突变、计算机辅助预测底物口袋相互作用、定向进化（如噬菌体辅助连续进化PACE）等策略，旨在改变其活性位点、底物结合区或引入新辅助结构域以增强特异性。需要注意的是，蛋白酶与底物需保持瞬时结合以确保循环利用，工程化时应避免干扰其天然的传感、调控和激活机制。诱导型激活是控制蛋白酶活性和创建显示库的有效策略。计算辅助的酶活性建模，如生成式人工智能工具RFdiffusion、RF All-atom、ProteinMPNN和ESM2，以及AlphaFold 3在生物分子复合物相互作用预测方面的进步，为设计高特异性、稳定且可由特定分子触发器控制的蛋白酶提供了强大支持。

底物工程是另一条路径，例如将天然底物（如Craspase的Csx30）的部分序列嫁接至目标蛋白，可使其成为蛋白酶靶标。该方法需要对蛋白酶特异性有深入了解，且工程化底物需被有效递送至作用位点。AI引导的技术也可用于设计蛋白酶底物，借鉴深度学习模型在蛋白质靶标结合物和抑制剂设计方面的原理，有望实现可编程的蛋白水解回路。

前景与挑战

PADS的发现极大地拓宽了对细菌免疫的理解。其可诱导、可编程的特性为生物技术应用（如生物传感、治疗、合成生物学）带来了创新机遇。例如，CRISPR控制的蛋白酶（如Craspase、PCaspase）已成功用于RNA诊断，通过蛋白质/肽切割作为读出信号。这些系统多层信号转导（如III型CRISPR-Cas将RNA感知与DNase、环化酶活性耦合）的特点，为整合蛋白酶模块提供了额外检查点，有利于实现更精确的控制并降低有害脱靶激活风险。

然而，将多组分蛋白酶系统应用于实际仍面临挑战，特别是在细胞环境中的递送和功能整合方面。对这些系统在生物通路中的精确控制需要递送技术的进步以及对系统生物学和细胞动力学的深入理解。未来研究将揭示PADS是否能满足这些期望，并解答关于其自然分布、进化、激活机制、靶标特异性、工程化灵活性以及在实际应用中效率与紧凑性等悬而未决的问题。