无需扩增的CRISPR-Cas系统与离心式数字微流控平台集成，用于多重呼吸道病原体核酸分析

《Analytical Chemistry》：Amplification-Free CRISPR-Cas System Integrated Centrifugal Digital Microfluidic Platform Developed for Multiplexed Respiratory Pathogen Nucleic Acid Analysis

　　基于离心数字微流控芯片的CRISPR-Cas9/Cas13a双检测系统，实现呼吸道病原体MRSA和H1N1亚拷贝级高灵敏度检测，无需前扩增且无假阳性，准确率100%，适用于资源受限场景。

　　

为应对在预防和控制呼吸道传染病方面对高灵敏度和快速多重检测技术的迫切需求，本研究开发了一种基于离心数字微流控芯片的集成CRISPR-Cas9/Cas13a检测平台。该平台旨在克服传统实时荧光定量PCR对专用设备和专业人员的依赖性。同时，它解决了现有等温扩增技术常见的假阳性问题，并满足了基于CRISPR的检测方法中对预扩增的需求。在本研究中，选择了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和甲型H1N1流感病毒作为模型病原体。首先开发并优化了片外CRISPR-Cas9/Cas13a双核酸检测系统，实现了对浓度为173 pM的MRSA-mecA DNA和浓度为117 pM的H1N1-HA RNA的高特异性检测。随后，设计了最佳的离心数字芯片结构并进行了筛选，使液滴填充率达到99.6%。最终将优化后的CRISPR系统集成到数字芯片中，显著提高了检测灵敏度：在37°C条件下，20分钟反应时间内，MRSA DNA的检测灵敏度达到0.7拷贝/μL，H1N1 RNA的检测灵敏度达到1.2拷贝/μL。此外，在所有20个模拟临床样本中，阴性和阳性检测的准确率均为100%。该平台以创新的方式将离心数字液滴分割技术与CRISPR-Cas系统相结合，实现了无需核酸预扩增即可检测亚拷贝水平的病原体。因此，这种便捷、经济且抗污染的方法为资源受限环境中的呼吸道病原体快速检测提供了可靠的解决方案。