敲除番茄中的果胶裂解酶可提高果实硬度，并降低叶片对病原体的敏感性

《Plant Science》：Knockout of a pectate lyase in tomato increases fruit firmness and reduces foliar susceptibility to pathogens

　　番茄SlPL基因CRISPR/Cas9编辑导致果实硬度提高、抗病性增强及细胞壁酶活性降低，且不影响其他品质指标。

　　番茄（*Solanum lycopersicum* L.）作为一种全球广泛种植的蔬菜作物，不仅在产量和种植面积上占据重要地位，还因其丰富的营养价值和对人类健康的益处而受到重视。随着全球气候变化、社会经济环境的不稳定以及对食品安全和减少食物浪费的持续关注，提高番茄的品质和农业性状成为植物育种领域日益重要的目标。番茄果实的软化过程在决定其采后品质方面起着关键作用，直接影响食物浪费和食品安全。为了深入理解一种称为果胶裂解酶（*SlPL*，*Solyc03g111690*）的酶在果实软化过程及病原体易感性机制中的作用，研究人员通过CRISPR/Cas9技术在Micro-Tom遗传背景中生成了敲除突变体。实验结果显示，两个无Cas9残留的编辑突变体（分别携带1个碱基插入和2个碱基缺失）在两个不同的成熟阶段（breaker+4和red ripe）表现出显著增加的果实硬度，并且在采后储存过程中表现出更低的重量损失。此外，观察到六种细胞壁重塑酶（包括果胶裂解酶、果胶甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、α-果糖苷酶、β-果糖苷酶和β-葡萄糖苷酶）的整体活性降低，以及对三种不同番茄病原体（*Botrytis cinerea*、*Phytophthora capsici*和*Pseudomonas syringae* pv. *tomato*）叶部感染的易感性降低，这表明改变细胞壁代谢可能限制了病原体的感染能力。这些发现为开发既满足农业和品质需求又有助于减少食物浪费的新番茄品种提供了可能性，同时也有助于阐明细胞壁分解过程的复杂性。

番茄在全球范围内广泛种植，是除块茎类作物外产量最高的蔬菜之一，2023年的产量达到19200万吨，种植面积也位居前列，约为540万公顷。中国和印度是番茄的主要生产国，其次是土耳其、美国、埃及和意大利。番茄富含多种对人类健康有益的化合物，如矿物质和抗氧化分子，包括番茄红素、β-胡萝卜素、维生素C、维生素E和多酚类物质。果实成熟过程中，色素如类胡萝卜素和黄酮类物质的积累，以及叶绿素的降解，是其代谢变化的一部分。随着果实成熟，细胞壁的重塑导致果实变软，糖分和挥发性化合物的含量增加，从而形成风味。因此，果实软化是番茄成熟过程中的一个核心事件，其机制涉及细胞壁结构的变化，包括果胶、纤维素和半纤维素的降解。

为了应对果实采后损失，番茄育种者长期致力于增强果实硬度，以提高收获和采后处理的效率，更好地保持产品品质并减少食物浪费。过去，一些自发成熟的突变体，如*ripening inhibitor*（*rin*）和*non-ripening*（*nor*），被广泛用于开发具有更好硬度和货架寿命的商业品种。然而，近年来研究发现，直接针对细胞壁重塑酶进行基因编辑可能是一种更有效的方法，以提高采后品质而不影响果实颜色和风味。已有研究显示，通过基因工程技术，对编码多聚半乳糖醛酸酶（*SlPG2a*）、β-果糖苷酶（*SlTBG4*）和木葡聚糖内转糖基酶/水解酶（*SlXTH5*）的基因进行编辑，可以有效改善果实硬度和储存寿命。最近的研究还表明，将*SlPG2a*和*SlPL*基因的突变结合起来，可以进一步提高果实硬度并减少水分流失。

在番茄中，已鉴定出22个*PL*基因，但只有*SlPL*在果实中高度表达，表明其在软化过程中可能扮演着关键角色。果胶裂解酶最初在病原菌*Erwinia carotovora*和*Bacillus* spp.中被描述，它们作为毒力因子在感染过程中起着重要作用。一旦病原菌穿透角质层，果胶作为屏障可以防止感染并刺激植物的免疫反应。在拟南芥中，改变编码果胶降解酶的基因表达，如*PME3*和PME抑制剂，可以增强植物对*Botrytis cinerea*和*Pectobacterium carotovorum*的抗性。此外，在*Alternaria brassicicola*中，删除PL编码基因*PL1332*可以降低病原菌的致病性。随着气候变化的加剧，病原体对作物的威胁可能进一步增加，因此寻找新的方法来应对作物病害变得尤为重要。

为了深入理解*SlPL*敲除对果实硬度、货架寿命、细胞壁重塑和病原体易感性的影响，研究人员在Micro-Tom遗传背景中采用了基因编辑技术。通过CRISPR/Cas9方法生成了两个突变体，它们在果实硬度和重量损失方面表现出优于野生型（WT）的特性。在突变体中，细胞壁重塑酶的整体活性降低，同时在叶部水平上对三种不同的番茄病原体表现出更低的易感性。这一发现首次在*SlPL*敲除突变体中被报道。

实验中，研究人员设计了一种针对*SlPL*第二外显子的20个核苷酸的单导RNA（sgRNA），并使用GoldenBraid（GB）克隆系统构建了CRISPR/Cas9载体。通过电穿孔将该载体转入*Agrobacterium tumefaciens* EHA105电感受细胞，并用于转化子叶组织。转基因植物在标准条件下生长，收集处于成熟阶段的果实（breaker+4和breaker+7，相当于红熟阶段）进行表型分析和生化研究。通过T7EI内切酶检测和TIDE分析，研究人员确认了突变体的编辑事件，并最终获得了具有同源突变的T3代植株。

实验结果显示，*SlPL*敲除突变体在果实硬度和重量损失方面显著优于野生型。此外，突变体果实的皱缩程度也明显降低。在突变体中，*SlPL*的相对表达量显著下降，表明基因编辑成功。同时，其他细胞壁重塑酶的活性也普遍降低，这与番茄果实中细胞壁结构的变化密切相关。果胶裂解酶的活性下降可能导致细胞壁结构的改变，从而影响果实的质地和抗性。此外，病原体的感染程度在突变体中显著降低，这可能与细胞壁的完整性增强有关。

研究还发现，*SlPL*的敲除不仅影响果实硬度，还可能改变果实的其他性状，如颜色和糖含量。在某些突变体中，L*和b*参数（反映颜色）的增加与果实成熟过程中类胡萝卜素（如番茄红素）的合成和叶绿素的降解有关。而其他性状如果实重量、形状指数和pH值在突变体和野生型之间没有显著差异，表明*SlPL*的敲除对这些非目标性状没有负面影响。这一结果表明，通过CRISPR/Cas9技术进行的特定基因编辑可以在不改变非目标性状的情况下有效提高果实硬度。

此外，研究还发现，*SlPL*的敲除可能影响其他细胞壁重塑酶的活性，例如果胶甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、α-果糖苷酶、β-果糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。这些酶的活性下降可能与*SlPL*在细胞壁重塑中的作用有关，因为它们共同参与果胶的降解过程。PL的活性下降可能导致果胶结构的改变，从而影响细胞壁的完整性，降低病原体的侵入能力。这一发现支持了PL在植物防御机制中的重要性，特别是在防止病原体感染方面。

研究还指出，PL在果实成熟过程中对细胞壁的降解起着关键作用，其活性的丧失可能影响细胞壁的结构和功能，从而增强植物的抗病能力。然而，与果实中的变化不同，叶部中其他细胞壁重塑酶的表达没有显著变化，这表明PL在叶部抗病性中的作用可能具有特异性。因此，进一步研究细胞壁代谢调控模块在叶部中的功能，有助于更全面地理解植物与病原体的相互作用机制。

综上所述，*SlPL*的敲除不仅改善了番茄果实的硬度和采后品质，还增强了其对多种病原体的抗性。这一研究为开发更耐储存、更抗病的番茄品种提供了新的思路，有助于提高番茄的市场竞争力和农业可持续性。未来的研究可以进一步探索PL在不同作物中的作用，以及如何通过基因编辑技术优化作物的品质和抗性。