一种新型的点击化学衍生大环三唑ium化合物，用于荧光开关方式检测亚硝酸根离子

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A novel click-derived macrocyclic triazolium for fluorescent turn-on sensing of nitrite ions

　　新型点击合成大环三唑受体TPETN对硝酸盐离子具有荧光 turn-on 检测功能，在水体系及食品细胞中表现出高灵敏度（3.01 nM）和选择性，通过AIE效应实现自组装纳米聚集体与蓝光增强。

　　

曾金生、李静、赵玉阳、肖申富、肖宇、张振文、张友辉、曹前进

南昌大学化学与化学工程学院，中国南昌 330031

摘要

有机大环受体是超分子识别领域的一个热门课题。在本研究中，设计并合成了一种新型的点击化学反应衍生的大环三唑类荧光探针TPETN，该探针以四苯乙烯作为荧光团，并具有三唑和酰胺氢离子作为结合位点。该探针专门用于检测亚硝酸根离子（NO₂^?）。TPETN表现出典型的聚集诱导发射（AIE）特性，能够以1:1的化学计量比选择性地与亚硝酸根离子结合，从而显著增强荧光强度。因此，在水溶液中，TPETN对亚硝酸根离子的检测限低至3.01?nM，并且适用于食品和活细胞中的亚硝酸根离子检测。

引言

亚硝酸根离子（NO₂^?）是自然界和人体中存在的重要无机物质[1]。亚硝酸根在工业上被广泛用作染色剂、抗菌剂和风味调节剂，也用于农业。它可以抑制细菌生长，并在食品加工过程中用作肉类腌制剂。然而，血液中过量的亚硝酸根会导致血红蛋白分子中的Fe(II)氧化为Fe(III)，从而阻碍血液的氧气运输能力，引发畸形和癌症[2,3]。世界卫生组织（WHO）规定亚硝酸根的最大日摄入量为0.07?mg/kg体重。食品法典委员会（CAC）规定腌肉制品中的亚硝酸根含量不得超过50?mg/kg，发酵蔬菜中的亚硝酸根含量不得超过20?mg/kg。饮用水中的亚硝酸根安全浓度应控制在3.0?mg/L以下，美国环境保护署（EPA）允许饮用水中的亚硝酸根含量不超过1.0?mg/L（21.7?μM）[4,5]。因此，开发一种灵敏的安全检测方法来检测生物体、水、食品和环境中的亚硝酸根离子非常重要。

目前，有许多用于检测亚硝酸根离子的方法，如高效液相色谱（HPLC）[6]、高效离子交换色谱（HPIEC）[7]、超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）[8]、分光光度法[9,10]、电化学方法[11,12,13,14]。这些方法在检测成本、仪器依赖性、操作便捷性和灵敏度方面都存在局限性。最近，荧光分析法因其高灵敏度、高选择性、低成本以及可用于活细胞成像而受到越来越多的关注[15,16,17]。因此，基于不同化学反应机制的各种荧光探针被设计和合成用于亚硝酸根的检测，其中最常用的是重氮化反应（包括偶氮化反应、偶氮连接剂形成及随后发生的重氮化水解）[18,19,20,21,22,23]。然而，基于反应的探针存在一些缺点，例如易受生物样本中某些还原剂和/或氧化剂的干扰、需要在高酸环境下工作、探针可能发生降解、荧光信号容易关闭以及响应时间较长[24,25]。因此，迫切需要开发一种高灵敏度、抗干扰、快速且定量的亚硝酸根检测方法，以便用于生物体成像[26]。

基于其独特的腔结构和主客体相互作用，大环受体在离子识别领域发挥着关键作用[27,28]。为了提高主客体相互作用，设计了具有多个酰胺、咪唑和三唑结合位点的大环受体，这些位点可以与离子形成氢键和配位键[29,30,31]。同时，大环受体通过两亲性修饰具有形成强预聚体的优势。例如，Beer报道了一种用于在DMSO-水混合体系中以1:1比例检测硫酸根离子的四唑类大环化合物[32]。我们团队也开发了基于三唑的受体用于检测碳酸根和磷酸根离子[33,34]。然而，由于亚硝酸根离子独特的V形几何结构和溶剂效应，在水中检测亚硝酸根极具挑战性。目前，仅有少数大环受体在有机溶剂中被报道具有多个亚硝酸根结合位点[35,36]。据我们所知，尚未有适用于纯水溶液中亚硝酸根检测的荧光化学传感器。

在本研究中，我们设计并合成了一种新型的点击化学反应衍生的大环三唑类荧光探针TPETN。该探针包含一个典型的聚集诱导发射（AIE）功能单元——四苯乙烯，两侧通过异佛尔酮连接三个三唑环，并连接了长烷基链。三唑和酰胺功能团在中性水环境中可作为与亚硝酸根离子形成氢键和静电键的结合位点。TPETN探针表现出聚集诱导发射特性，能够在水溶液中自组装成纳米聚集体，并快速识别亚硝酸根离子，产生强烈的蓝色荧光[图1b]。该探针可用于检测食品样品和细胞中的亚硝酸根离子，显示出巨大的生物医学应用潜力。

材料与设备

N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、过氧化苯甲酰（BPO）、4,4′-苯酚酮、4-羟基苯酚酮、1-溴代己烷等试剂均从商业供应商处购买，除非另有说明，否则直接使用无需进一步纯化。

使用Varian仪器记录¹H NMR（400?MHz）和¹³C NMR光谱（101?MHz）。Hitachi UV-3010和Hitachi F-4500分光光度计分别用于记录吸光度和荧光光谱。Zeiss LSM 710激光扫描共聚焦显微镜用于观察样品结构。

设计与合成

TPETN探针的合成过程如方案2所示。首先，在四氯化钛和锌的存在下，苯酚酮衍生物发生羰基缩合反应并脱氧生成四苯乙烯衍生物。然后对这些衍生物进行卤代烃取代以引入烷基链，随后甲基被溴化并引入叠氮基团。接着与炔烃进行点击反应得到中间体。

食品样品中亚硝酸根离子的检测

为了评估该探针的实际应用效果，使用TPETN检测了氯化钠、腌萝卜、鸡脚、酸豆、莲根和熏肉样品中的亚硝酸根离子。如表1所示，亚硝酸根的回收率为97.5–107.5%，相对标准偏差（n = 5）不超过2.69%。这表明TPETN能够准确且高效地定量检测实际食品样品中的亚硝酸根离子[46,47]。此外，基于TPETN的试纸条也被成功应用于亚硝酸根的检测。

结论

总之，通过点击化学反应成功构建了一种新型的三唑类有机大环受体TPETN，它能够选择性地快速检测食品样品和细胞内的亚硝酸根离子。在HEPES缓冲溶液中，TPETN对亚硝酸根离子在0–14?μM范围内的响应呈线性（R² = 0.990），检测限为3.01?nM。基于TPETN的试纸条已成功应用于食品样品中亚硝酸根的检测。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：22061028和22361028）和江西省自然科学基金（项目编号：20224ACB203012）的支持。