用于工业生产果寡糖（FOS）的新型生物催化剂：这些催化剂由岩藻糖转移酶基因和突变后的转化酶基因组成，这些基因在Komagataella phaffii（先前称为Pichia pastoris）中持续表达

《CyTA - Journal of Food》：Novel biocatalysts for industrial fructooligosaccharides (FOS) production from fucosyltransferase and mutagenized invertase genes constitutively expressed in Komagataella phaffii (previously Pichia pastoris)

　　短链果聚糖（FOS）生产通过改造高温细菌β-果糖苷酶（BfrA）和植物1-果糖基转移酶（1-SST），在酵母Komagataella phaffii中高效表达，显著提升FOS产量及β-(2→6)连接型FOS比例，为工业化生产提供新生物催化剂。

　　在现代食品工业中，短链果聚糖（FOS）作为一种重要的功能性成分，因其益生元特性、低热量以及在食品加工中的多重用途而受到广泛关注。FOS通常由蔗糖在特定酶的作用下生成，主要包括果糖基转移酶（Fructosyltransferases, FTFs）和转化酶（invertases）等。然而，目前FOS的大规模生产仍然主要由少数大型企业垄断，限制了其在更广泛领域的应用。为此，本研究首次引入了两种新型的酶催化剂，旨在通过工业级生物催化手段提高FOS的产量和种类，从而满足市场需求。

本研究的创新点在于利用两种来源不同的酶进行改造和表达。其中一种是来自极端嗜热菌 *Thermotoga maritima* 的β-果糖苷酶（BfrA），其天然特性是能够在高温条件下（60°C至70°C）高效地将蔗糖转化为短链FOS。通过位点特异性诱变技术，研究人员对BfrA的某些关键氨基酸位点进行了修改，以增强其果糖基转移活性，减少对水的水解作用，从而提高FOS的产出比例。这些经过改造的BfrA变体在 *Komagataella phaffii* 菌株中实现了稳定的表达，为工业应用提供了全新的可能性。

另一种新型酶是来自植物 *Schedonorus arundinaceus* 的蔗糖：蔗糖1-果糖基转移酶（1-SST）。该酶在植物中主要负责果聚糖的合成，其产物以1-kestose为主，具有较高的商业价值。通过构建多拷贝表达载体，研究人员在 *Komagataella phaffii* 中实现了1-SST的高表达水平。这种策略不仅提高了酶的产量，还增强了其在工业条件下的稳定性和效率。此外，通过将甘油作为碳源替换为甘蔗糖，进一步降低了生产成本，并提升了酶的活性。

在实验过程中，研究人员对这两种酶的性能进行了系统的评估。通过在不同温度和蔗糖浓度条件下进行酶活性测试，发现经过改造的BfrA变体在高温下表现出显著的果糖基转移活性增强，且能够稳定地合成β-(2→6)连接的FOS。相比之下，未改造的BfrA虽然在高温下具有良好的蔗糖转化能力，但其产物中果糖基转移产物的比例较低，限制了其在FOS生产中的应用价值。因此，通过位点突变优化后的BfrA变体在FOS生产中具有更大的优势。

对于1-SST的表达，研究人员通过构建包含多个拷贝的基因表达载体，使得 *Komagataella phaffii* 菌株能够高效地分泌这种植物来源的酶。实验结果显示，随着拷贝数的增加，1-SST的表达水平和催化效率也随之提升。特别是当使用甘蔗糖作为碳源时，酶的活性进一步增强，达到了60 U/mL的水平。此外，通过高通量的液相色谱分析，研究人员能够准确地检测和量化不同类型的FOS产物，从而验证了酶的催化特异性。

在实际应用方面，这两种新型酶催化剂的工业价值在于其能够克服传统方法中的一些限制。例如，传统上FOS的生产依赖于丝状真菌，如 *Aspergillus* 属和 *Aureobasidium* 属，这些菌株在大规模生产过程中容易形成菌丝团，影响发酵设备的正常运行。而 *Komagataella phaffii* 作为重组表达宿主，不仅具有良好的安全性（被美国食品药品监督管理局列为GRAS级），还具备高效分泌和糖基化外源蛋白的能力，适合于工业级生产。此外，该酵母菌株能够在高细胞密度条件下生长，并且具有遗传稳定性和易于操作的特性，进一步增强了其作为生物催化剂的可行性。

实验结果表明，这两种新型酶在FOS生产中表现出优异的性能。例如，经过改造的BfrA变体能够在50°C至70°C的温度范围内保持较高的催化活性，同时其产物中果糖基转移产物的比例显著提高，达到38%（w/w）的总FOS产量。而对于1-SST，其在甘蔗糖作为底物的情况下，能够高效地合成1-kestose和nystose等短链FOS，且产物中β-(2→1)连接的FOS占比高达90%。这些数据表明，这两种酶不仅在催化效率上优于传统方法，而且在产物多样性方面也具有明显的优势。

从市场角度来看，FOS的应用领域正在不断扩大。其不仅被广泛用于婴幼儿配方食品、糖尿病友好型甜味剂和动物饲料中，还因其益生元特性在功能性食品和饮料中发挥重要作用。据市场研究报告显示，FOS的市场规模正在以每年7.7%的速度增长，预计到2029年将达到42.5亿美元。与此同时，转化糖（invert sugar）市场也呈现稳步增长的趋势，其年复合增长率约为4.5%。这表明，FOS及其相关产品的市场需求正在持续上升，推动了对高效、稳定的生物催化剂的研发。

本研究的成果为FOS的工业化生产提供了新的解决方案。通过基因工程手段，研究人员成功地将两种来源不同的酶改造并表达在 *Komagataella phaffii* 中，不仅提高了FOS的产量，还拓展了其种类。这些新型酶催化剂的稳定性、高效性和安全性，使其成为替代传统丝状真菌的可行选择。此外，通过使用甘蔗糖作为碳源，研究人员还降低了生产成本，进一步提升了其在工业应用中的竞争力。

总的来说，本研究为FOS的生产提供了重要的技术突破。通过优化酶的结构和表达系统，研究人员成功开发出两种具有高活性和稳定性的新型生物催化剂，为食品工业中FOS的规模化生产提供了新的思路和方法。这些成果不仅有助于满足日益增长的市场需求，还为未来的生物技术应用提供了宝贵的参考。随着这些酶催化剂的进一步推广和应用，FOS在功能性食品、甜味剂和营养补充剂等领域的价值将得到更充分的体现。