单细胞图谱揭示骨膜衰老机制：祖细胞功能衰退与免疫微环境失衡驱动骨稳态失调

《Cell Regeneration》：Single-cell mapping reveals age-related alterations in periosteal progenitor cells and immune microenvironment

　　本研究针对衰老进程中骨膜再生能力下降的机制空白，通过单细胞RNA测序技术系统解析了小鼠骨膜在3月、9月及18月龄的细胞动态变化。研究发现衰老导致骨膜祖细胞（pSSCs）亚群（Dpt+纤维层细胞与Postn+生发层细胞）呈现异质性衰老轨迹，并伴随促炎性Cd38hi巨噬细胞和Nlrp3hi中性粒细胞浸润。关键信号通路（如CSF1-CXCL轴）介导的祖细胞-免疫细胞互扰加剧骨流失。该研究为靶向干预年龄相关性骨疾病提供了新视角。

　　

随着年龄增长，骨骼系统的再生能力显著下降，骨折愈合延迟和骨质疏松等问题日益突出。骨膜作为覆盖在骨骼表面的关键组织，富含具有成骨潜能的祖细胞，在骨修复和稳态维持中发挥核心作用。然而，衰老如何影响骨膜细胞组成、功能及其微环境互动，至今尚不明确。这一科学盲区限制了针对老年性骨疾病的有效治疗策略的开发。

为解决这一问题，赵磊、吴超等研究人员在《Cell Regeneration》上发表了题为“Single-cell mapping reveals age-related alterations in periosteal progenitor cells and immune microenvironment”的研究。他们通过对年轻（3月龄）、中年（9月龄）和老年（18月龄）小鼠骨膜进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），构建了首张骨膜衰老的高分辨率细胞图谱，揭示了祖细胞功能衰退与免疫细胞失衡共同驱动骨稳态失调的新机制。

关键技术方法

研究团队采集了C57BL/6小鼠股骨和胫骨骨膜组织，通过酶消化法获得单细胞悬液，利用10x Genomics平台进行scRNA-seq建库和测序。采用Seurat软件进行细胞聚类和注释，通过CellChat分析细胞间通讯，并使用SenMayo基因集进行衰老评分。实验验证包括免疫荧光染色（检测Mrc1⁺和Cd38^hi巨噬细胞）、流式细胞术（分析中性粒细胞和巨噬细胞比例）以及Transwell共培养实验（评估祖细胞对巨噬细胞迁移的影响）。

研究结果

1. 骨膜细胞组成的年龄依赖性变化

单细胞图谱鉴定了7种骨膜细胞类型：中性粒细胞（S100a8⁺/S100a9⁺）、巨噬细胞（Cd14⁺/Csf1r⁺）、间充质细胞（Pdgfra⁺）、T/NK细胞、B细胞、内皮细胞和红细胞。衰老导致间充质细胞比例显著下降，而中性粒细胞和巨噬细胞比例上升。通路富集分析显示，老年组白细胞跨内皮迁移、中性粒细胞胞外诱捕网形成等免疫相关通路激活，而黏着斑、Wnt信号等成骨相关通路被抑制。

2. 细胞通讯网络的重编程

CellChat分析发现，衰老削弱了间充质细胞的自我信号（如EGF、PTN），但增强了其与内皮细胞的互动。巨噬细胞向T细胞的信号传递增强，而间充质细胞向中性粒细胞的信号减弱。CSF信号在老年巨噬细胞和间充质细胞中显著富集，提示其在衰老相关炎症中起关键作用。

3. 骨膜祖细胞的异质性衰老响应

间充质细胞进一步分为6个亚群：C0（Runx2⁺/Spp1⁺）、C1（Dpt⁺纤维层祖细胞）、C2（Postn⁺生发层祖细胞）、C3（Eng⁺）、C4（Sox9⁺）和C5（Lepr⁺）。Dpt⁺细胞在中年即出现早衰特征（氧化磷酸化功能受损），而Postn⁺细胞虽衰老评分较低，但其成骨基因（如Serpinh1、Gja1）表达随年龄下降。两类祖细胞均出现促血管生成因子Sparc的持续性下调。

4. 中性粒细胞功能失调

中性粒细胞分为Nlrp3^hi（C0）和Pclaf^hi（C1）亚群。Nlrp3^hi细胞高表达炎症因子（Il1b、Cxcl2），但衰老后NF-κB、Toll样受体等通路活性降低，其分泌的成骨支持因子（如Sparc、Dcn）减少，提示其骨修复功能衰退。

5. 巨噬细胞亚群失衡

巨噬细胞中，Mrc1⁺（C4）亚群（兼具M1/M2表型）在衰老后比例下降，且TGF-β信号减弱；而Cd38^hi（C6）M1样巨噬细胞显著增加，高表达骨形成抑制因子Saa3。免疫荧光验证了老年骨膜中Cd38^hi细胞浸润增多。

6. 祖细胞-免疫细胞互扰加剧骨流失

衰老间充质细胞通过高表达Csf1和CXCL1/CXCL12，分别招募Cd38^hi巨噬细胞和Nlrp3^hi中性粒细胞。共培养实验证实，老年祖细胞可增强巨噬细胞迁移能力。与此同时，巨噬细胞向祖细胞传递的成骨支持信号（如TGF-β、SPP1）显著减弱，形成恶性循环。

结论与意义

本研究首次在单细胞分辨率下揭示了骨膜衰老的核心特征：祖细胞功能衰退与免疫微环境失调相互交织，通过CSF1-CXCL信号轴放大炎症反应，抑制成骨修复。Dpt⁺祖细胞的早衰和Postn⁺祖细胞的成骨能力下降，以及Cd38^hi巨噬细胞、Nlrp3^hi中性粒细胞的积累，共同导致骨稳态失衡。该发现不仅深化了对骨骼衰老机制的理解，也为靶向干预CSF1、CXCL等信号通路以逆转年龄相关性骨疾病提供了新思路。