评估一种基于芳香柚叶和花蕾精油组合开发的纳米制剂的抗菌、抗真菌和抗黄曲霉毒素活性

《Sustainable Food Technology》：Assessing the antibacterial, antifungal, and antiaflatoxigenic activity of a developed nanoformulation based on a combination of Syzygium aromaticum leaf and bud essential oils

　　本研究开发了一种基于丁香叶和花蕾精油组合（SACEO）的纳米制剂（Ne-SACEO），通过纳米封装显著提高了其抗菌、抗真菌和抗黄曲霉毒素生成活性。GC-MS分析显示SACEO中主要活性成分为邻苯二酚。Ne-SACEO通过破坏真菌细胞膜（降低 ergosterol含量）、干扰膜电位和离子泄漏，以及抑制细菌膜结构和蛋白质合成，展现出广谱抗菌活性。分子对接表明邻苯二酚与关键酶（如FabL）结合，抑制脂肪酸合成。纳米封装增强了稳定性、缓释特性及生物利用度，为绿色食品防腐剂提供了新策略。

　　本研究围绕一种基于香叶和花芽精油的纳米制剂展开，旨在解决食品中霉菌毒素污染和抗菌药物耐药性日益严重的全球性问题。随着食品安全问题的加剧，传统的合成抗菌剂因其潜在的健康风险和环境影响而受到越来越多的关注。因此，科学家们开始探索天然抗菌剂，尤其是具有广谱抗菌活性的植物来源化合物。本研究的创新之处在于利用纳米封装技术提升精油的生物活性，使其成为一种绿色、高效且可持续的食品保鲜剂。该纳米制剂（Ne-SACEO）由香叶和花芽精油组合（SACEO）制成，通过GC-MS分析确定了其中的主要活性成分——meta-eugenol，并进一步评估了其抗菌、抗真菌和抗黄曲霉毒素的潜力。

研究首先介绍了精油的提取过程。香叶和花芽分别采用水蒸气蒸馏法进行提取，通过Clevenger装置在90℃下处理3小时。提取后的精油使用无水硫酸钠去除多余水分，并在4℃下保存以备后续实验使用。为了分析精油的协同作用，研究者将其按不同比例（1:1, 1:2, 2:1, 1:3, 3:1）混合，并对每种组合的抗菌活性进行测试。结果表明，1:3比例的精油组合展现出最佳的抗菌效果，因此被选为后续研究的对象。

随后，研究者采用低分子量脱乙酰壳聚糖和肉桂酸作为原料，通过EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺）作为交联剂，制备了壳聚糖-肉桂酸纳米凝胶。这种纳米结构为精油提供了稳定的载体，同时提高了其在水中的分散性和生物可利用性。纳米封装的实现过程包括将精油溶解于纳米凝胶的疏水核心中，通过超声波处理形成纳米级颗粒。研究还利用动态光散射（DLS）和Zeta电位技术对纳米制剂的物理化学性质进行了表征，确认其具有均匀的粒径分布、稳定的电荷状态以及良好的分散性。

在抗菌和抗真菌活性评估方面，研究通过MTT比色法测试了不同精油组合对多种食品相关微生物的影响，包括沙门氏菌（S. enterica）、志贺氏菌（S. flexneri）、金黄色葡萄球菌（B. cereus）和大肠杆菌（E. coli）。结果显示，Ne-SACEO在较低浓度下就能有效抑制这些微生物的生长，且其最低抑菌浓度（MIC）和最低黄曲霉毒素抑制浓度（MAIC）显著低于未封装的SACEO。例如，对黄曲霉菌（A. flavus）的MAIC值为0.15 μL mL?1，而SACEO的MAIC值为0.2 μL mL?1。这表明纳米封装技术显著增强了精油的抗菌和抗毒素生成能力，使其在食品保鲜中具有更高的应用潜力。

此外，研究还探讨了Ne-SACEO的抗菌和抗真菌作用机制。通过细胞膜完整性实验发现，Ne-SACEO能够破坏真菌细胞膜的结构，导致膜完整性下降、细胞内容物泄漏以及细胞膜电位（MMP）的丧失。这些变化与细胞膜中ergosterol（麦角甾醇）的减少密切相关，ergosterol是维持真菌细胞膜功能和稳定性的关键成分。实验表明，随着Ne-SACEO浓度的增加，ergosterol的含量显著下降，最终导致真菌细胞死亡。对于细菌而言，Ne-SACEO同样表现出对细胞膜的破坏作用，具体表现为膜电位下降、膜流动性降低、细胞内离子（如K?）泄漏以及细胞内容物（如DNA和RNA）的释放。这些现象表明，Ne-SACEO能够有效干扰细菌的细胞膜结构，进而影响其代谢过程和生存能力。

为了进一步验证这些作用机制，研究者还采用了分子对接技术，分析了meta-eugenol与多种微生物靶点蛋白的结合能力。通过构建高精度的同源模型，并模拟其与目标蛋白的结合过程，研究发现meta-eugenol能够与多个关键酶和蛋白质结合，包括脂肪酸合成酶（FabL）、氧化还原调节蛋白（Afnor1）和甲基转移酶（Afomt1）。这些结合不仅显示出较高的亲和力，还揭示了meta-eugenol可能通过干扰脂肪酸合成、氧化还原平衡和细胞信号传导途径来发挥其抗菌和抗毒素生成作用。这种多靶点作用机制使得meta-eugenol在抑制微生物活性方面具有更广泛的适用性。

在抗氧化活性方面，Ne-SACEO表现出显著的自由基清除能力。通过DPPH和ABTS自由基清除实验，研究者发现Ne-SACEO在低浓度下（如0.005 μL mL?1）即可有效抑制自由基，其清除率随着浓度的增加而显著提高。DPPH清除实验中，Ne-SACEO的清除率在0.035 μL mL?1时达到64.84%，而ABTS清除实验中，清除率则高达71.21%。这些结果表明，纳米封装不仅提高了精油的抗菌性能，还增强了其抗氧化活性，使其在食品保鲜中具有双重作用——既能抑制微生物生长，又能防止食品氧化变质。

研究进一步探讨了Ne-SACEO的释放特性。通过模拟体外释放实验，研究发现Ne-SACEO表现出持续且可控的释放模式。在最初的12小时内，约有20-25%的精油迅速释放，随后释放速度逐渐减缓，48小时后释放量达到约60%，并在84小时后接近80%，最终在100小时后达到饱和。这种释放模式确保了纳米制剂在食品体系中的长期稳定性，同时提高了其对微生物的持续抑制能力。此外，Ne-SACEO的粒径分布和Zeta电位分析表明，其具有良好的分散性和稳定性，这为实际应用提供了重要的物理基础。

在实际应用层面，Ne-SACEO被证实能够有效抑制多种食品中常见的微生物污染。通过与传统合成抗菌剂（如苯甲酸和山梨酸）的对比，研究发现Ne-SACEO的MIC和MAIC值更低，表明其具有更高的抗菌和抗毒素生成效率。这种高效性使得Ne-SACEO成为一种具有潜力的天然食品保鲜剂，特别是在需要长时间保存的食品体系中。此外，由于其来源于植物，Ne-SACEO不仅具备良好的生物相容性，还符合绿色化学和可持续发展的理念。

本研究的结论强调了纳米封装技术在提升天然抗菌剂生物活性方面的重要作用。通过将香叶和花芽精油封装于壳聚糖-肉桂酸纳米结构中，Ne-SACEO不仅提高了精油的稳定性，还增强了其在食品环境中的渗透性和持久性。这种技术的结合使得Ne-SACEO能够在较低浓度下实现对多种微生物的高效抑制，从而为食品工业提供了一种更加安全、环保的保鲜解决方案。此外，研究还指出，meta-eugenol作为主要活性成分，可能通过多种途径影响微生物的代谢和生存，包括干扰脂肪酸合成、破坏细胞膜结构以及诱导氧化应激反应。

未来的研究可以进一步探索Ne-SACEO在不同食品体系中的应用效果，包括其在食品储存、运输和加工过程中的实际表现。此外，纳米制剂的长期稳定性和潜在的细胞毒性也需要进行更深入的评估，以确保其在食品工业中的安全性和可行性。随着纳米技术在食品科学中的不断发展，像Ne-SACEO这样的新型天然抗菌剂有望成为传统化学防腐剂的重要替代品，为食品安全和可持续发展提供新的思路。

本研究不仅为食品微生物污染的控制提供了新的策略，也为植物来源抗菌剂的开发和应用提供了科学依据。通过结合精油的天然抗菌特性与纳米封装技术的优势，Ne-SACEO展现出良好的抗菌、抗真菌和抗毒素生成能力，这使其在食品保鲜和抗菌领域具有广阔的应用前景。同时，研究结果也为进一步探索其他植物精油的纳米封装技术提供了参考，有助于推动绿色、高效、可持续的抗菌剂研发进程。