利用超临界流体从Lagerstroemia speciosa叶片中提取有价值化合物，以研究其在体外抗糖尿病和抗氧化活性方面的作用

《Sustainable Food Technology》：Optimization of supercritical fluid extraction of valuable compounds from Lagerstroemia speciosa leaves for in vitro antidiabetic and antioxidant activity

　　抗氧化活性与抗糖尿病潜力超临界CO2萃取洛塔罗梅亚叶酚类化合物的研究摘要：本研究首次通过响应面法优化超临界CO2萃取参数（29.59 MPa，89.50℃，53.85 min），从洛塔罗梅亚叶中高效提取总酚含量达99.31±2.57 mg GAE/g干生物量，并鉴定出香草酸、木脂素酸等关键酚类物质。UPLC-PDA分析显示其抗氧化活性IC50为70.43±4.36 μg/mL，对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性IC50分别为30.09±2.58和59.45±3.40 μg/mL，展现出显著的抗氧化和抗糖尿病潜力。

　　本研究首次采用响应面法（RSM）对超临界CO?提取（SFE）从**Lagerstroemia speciosa**（Banaba）叶片中的酚类化合物进行优化，目标是评估其抗氧化和抗糖尿病的潜力。与传统的溶剂提取法不同，SFE是一种绿色、可调节的提取方法，能够高效回收热不稳定生物活性化合物。研究中通过调整压力（20–40 MPa）、温度（70–110 °C）和时间（30–70 min）等关键参数，优化了提取条件，最终在29.59 MPa、89.50 °C和53.85 min的条件下获得了高达99.31 ± 2.57 mg GAE/g干基的总酚含量（TPC）。通过超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器（UPLC-PDA）分析，确认了提取物中包含多种重要的酚类化合物，如对羟基苯甲酸、香草酸、对香豆酸、绿原酸和香草醛。这些成分不仅具有较强的抗氧化能力，还表现出显著的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC??值分别为30.09 ± 2.58 μg mL?1和59.45 ± 3.40 μg mL?1。这些结果表明，**LS**叶片中富含具有潜在生物活性的酚类物质，可作为开发功能性食品、营养补充剂和药物的天然资源。

### 绿色化学与可持续性

本研究强调了绿色化学在植物资源利用中的重要性。传统的有机溶剂提取法虽然在某些情况下能够获得高产率，但通常伴随着溶剂的高毒性和环境负担，而SFE则以二氧化碳为溶剂，这种溶剂不仅无毒，还具有可回收性和低环境影响。CO?在超临界状态下，能够作为高效的提取介质，适用于多种生物活性物质的提取。研究中所采用的SFE方法不仅减少了对环境的污染，还确保了热敏感化合物的稳定性，有助于推动“清洁标签”运动，提高植物来源功能性成分的可持续性。因此，该研究在环保和资源高效利用方面具有重要的意义，尤其适用于食品、制药和化妆品行业对天然提取物的需求。

### 材料与方法

研究使用了多种分析级化学品，包括α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（PNPG）、淀粉、磷酸盐、Folin–Ciocalteu试剂、AlCl?、DPPH（2,2-二苯基-1-苦味肼）和碳酸钠。其中，99.9%纯度的CO?购自Sigma Gases公司。**LS**叶片的采集地点位于印度旁遮普邦莫哈利的创新与应用生物加工中心（CIAB）校园，GPS坐标为30.6497° N；76.7396° E。叶片经过流水清洗后，在45 °C下干燥至含水量8–9%，随后通过粉碎和筛分处理，使颗粒大小保持一致，以提高实验的可重复性和结果的准确性。

在SFE过程中，系统由双活塞泵驱动，将液态CO?注入提取装置，再通过预热器和加热夹套达到超临界状态。CO?的流速控制在2.0 ± 0.1 mL min?1，以确保提取过程的稳定性。实验中采用了中心复合设计（CCD）来筛选和优化关键变量，包括压力、温度和时间，而CO?流速和颗粒大小则保持不变。在20次实验中，CCD建议了8个因子实验、6个轴向实验和6个中心点实验，以确保模型的准确性和可重复性。研究使用Design Expert 13.0.5.0软件对实验数据进行分析，以优化TPC的提取效果。

### 结果与讨论

研究中采用的二次模型对提取条件的预测效果良好，模型显著性达到96.65%。分析结果表明，TPC的提取效果受到压力、温度和时间的线性影响，其中压力的影响最为显著。此外，压力与温度的交互作用对TPC的提取效果也有明显影响。例如，在压力保持在30 MPa的情况下，温度越高，CO?的密度越低，可能导致溶剂与样品的相互作用减少，从而降低提取效率。然而，温度的升高也加快了酚类化合物的溶解速率，提高了提取效果。因此，最终的最优温度设定为89.50 °C，这在统计分析中得到了验证。

提取时间的影响相对较小，但仍有显著变化。实验中发现，当时间从50分钟增加到83.63分钟时，TPC的提取量有所下降。这可能是因为在较长的提取时间下，样品中的热敏感成分可能发生降解，影响整体的提取效果。研究中采用的最优提取时间为53.85分钟，所获得的TPC含量为99.31 ± 2.57 mg GAE/g干基，接近模型预测值（102.749 mg GAE/g干基）。这一结果验证了SFE优化模型的有效性，同时也表明该方法能够实现高产率的酚类提取。

此外，通过FE-SEM对提取前后叶片表面结构的变化进行了分析，结果显示在高压下，CO?能够深入细胞结构，促进物质的扩散，从而提高提取效率。但因颗粒大小不一，难以直接对比提取前后的微观结构变化。该研究进一步利用UPLC-PDA分析了提取物中的酚类化合物，并成功鉴定出多种关键成分，如对羟基苯甲酸、香草酸、对香豆酸、绿原酸和香草醛。这些化合物的含量较高，且具有显著的抗氧化和抗糖尿病潜力。

### 纯化与结构分析

在提取完成后，研究进一步采用Diaion HP-20柱层析技术对香草酸和对香豆酸进行了纯化。通过改变甲醇浓度，实验发现随着甲醇比例的增加，这些化合物的脱附效率也相应提高。纯化后的样品通过UPLC-PDA进行定量分析，结果显示在90%甲醇条件下，香草酸和对香豆酸的浓度分别为376.23 μg mL?1和393.25 μg mL?1。随后，通过1H NMR对纯化后的化合物进行了结构确认，进一步验证了其化学结构和纯度。研究中发现，香草酸和对香豆酸的结构特征与其抗氧化和酶抑制活性密切相关。

### 抗氧化与抗糖尿病活性评估

通过DPPH自由基清除实验评估了提取物和纯化成分的抗氧化活性。实验结果表明，SFE-**LS**提取物在20–100 μg mL?1的浓度范围内表现出显著的自由基清除能力，其IC??值为70.43 ± 4.36 μg mL?1。相比之下，香草酸的IC??值为32.76 ± 6.6 μg mL?1，显示出更强的抗氧化活性。而对香豆酸的IC??值为56.80 ± 7.5 μg mL?1，虽然活性不如香草酸，但仍表现出较强的抗氧化能力。这些结果表明，SFE-**LS**提取物中富含具有强抗氧化能力的酚类化合物，且这些成分在提取过程中未受到显著的氧化降解。

在抗糖尿病活性方面，SFE-**LS**提取物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶表现出显著的抑制效果。其中，α-淀粉酶的IC??值为30.09 ± 2.58 μg mL?1，而α-葡萄糖苷酶的IC??值为59.45 ± 3.40 μg mL?1。这些结果表明，**LS**叶片中提取的酚类化合物在抑制糖分分解方面具有重要的应用潜力。香草酸的IC??值为22.91 ± 0.5 μg mL?1，显示出与标准药物阿卡波糖（IC??为20.97 ± 0.86 μg mL?1）相当的抗糖尿病活性。相比之下，对香豆酸的IC??值较高，表明其在抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶方面的效果较弱，但与香草酸和绿原酸结合时可能产生协同效应。

### 潜在机制与应用前景

研究进一步探讨了这些酚类化合物在抗氧化和抗糖尿病活性中的可能作用机制。例如，香草酸和对香豆酸可能通过氢键和疏水作用与酶的活性位点结合，从而抑制其活性。此外，它们的分子结构中富含羟基，这可能使其具备较强的电子或氢原子供体能力，有助于清除自由基并稳定其反应中间体。这些特性使SFE-**LS**提取物在抗氧化和抗糖尿病方面表现出显著的潜力。

值得注意的是，虽然本研究中SFE-**LS**提取物的抗氧化和抗糖尿病活性得到了验证，但实验仍局限于**in vitro**条件。因此，未来的研究需要进一步探索其在**in vivo**环境下的效果，包括对生物体内代谢过程和疾病机制的影响。此外，提取物的稳定性、安全性以及在不同储存条件下的表现也需要进一步研究，以确保其在实际应用中的可行性。

### 结论

综上所述，本研究通过SFE技术优化了**LS**叶片中酚类化合物的提取条件，并首次揭示了该植物中酚类成分的详细组成及其生物活性。优化后的提取参数（29.59 MPa、89.50 °C、53.85 min）不仅实现了高产率的TPC提取，还为功能性食品、营养补充剂和药物开发提供了新的思路。此外，研究还证明了SFE在提取过程中对热敏感化合物的保护作用，符合绿色化学的发展趋势。尽管本研究目前仅限于实验室规模和**in vitro**实验，但其结果为未来的大规模生产、产品开发以及相关应用奠定了良好的基础。通过进一步的实验验证和工业化应用，SFE-**LS**提取物有望成为具有实际应用价值的天然功能性成分。

### 展望未来

未来的研究可以围绕几个关键方向展开。首先，需要进一步验证SFE-**LS**提取物在**in vivo**环境下的效果，包括其在人体内的代谢途径、生物利用度以及对糖尿病相关疾病的潜在治疗效果。其次，可以探索该提取物在不同储存条件下的稳定性，以确保其在实际应用中的长期保存能力。此外，针对不同的植物种类和地理来源，研究其酚类成分的差异，有助于更全面地了解植物资源的多样性及其对提取物活性的影响。最后，可以结合代谢组学和基因组学技术，深入探讨**LS**叶片中酚类化合物的生物合成途径及其在植物中的分布规律，为植物资源的高效利用和开发提供理论支持。