LncRSFD的可变剪接通过调控miRNAs来影响脂肪细胞的增殖和分化

《Animal Research and One Health》：LncRSFD Alternative Splicing Modulates the Proliferation and Differentiation of Adipocytes Through Sponging miRNAs

　　脂肪沉积分子调控机制研究：以绵羊lncRSFD-L/S为例

　　本研究聚焦于长链非编码RNA（lncRNA）在羊脂肪沉积中的作用，特别是其剪接变异体（lncRSFD-L和lncRSFD-S）对脂肪细胞增殖、分化及脂质代谢的调控机制。脂肪沉积是畜牧业中影响肉质和代谢健康的关键因素，其分子调控机制仍需深入研究。近年来，lncRNA的剪接事件被发现与脂肪组织积累密切相关，并在动物中广泛存在。然而，尽管lncRNA剪接在脂肪形成中具有潜在的调控作用，其在脂肪生成中的具体功能仍存在许多未知领域。通过研究lncRSFD的剪接变异体，本研究揭示了它们在脂肪细胞发育过程中的双重调控效应，并为分子育种策略提供了新的理论依据。

脂肪组织的沉积和发育不仅决定了动物的生产性能，还直接影响肉质、风味和代谢效率。随着生活水平的提高，全球对羊肉的需求持续上升，但羊脂肪，尤其是尾脂肪的利用效率仍然较低。在中国的地方羊种中，如兰州脂肪尾羊（LFTS），尾脂肪的积累是一种独特的适应性特征，受到地区饮食习惯和环境适应的影响。然而，这种特征也伴随着尾脂肪异常积累的现象，使得其他部位的脂肪沉积相对较少。尽管这种脂肪沉积模式在文化和经济上具有重要价值，但过度的脂肪沉积会降低饲料转化效率，增加养殖成本和环境负担。相反，脂肪储备不足可能会影响肉质和动物健康，因此在可持续的羊养殖中，平衡脂肪生成具有重要意义。

脂肪生成是一个复杂的生物学过程，由多个调控网络共同协调完成，包括非编码RNA（ncRNA）、转录因子、信号通路以及表观遗传修饰。这些成分通过动态交互作用，推动前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化，同时调控脂质代谢，维持能量平衡，并影响脂肪组织的形成及其生理功能。其中，PPARγ和C/EBPα作为核心转录因子，协同驱动脂肪细胞的分化。PPARγ被称为脂肪生成的“主开关”，能够激活脂肪生成相关基因的表达，促进脂质合成与储存，并促进前脂肪细胞的终末分化。C/EBPα则通过激活PPARγ的表达并与其协同作用，进一步促进脂肪生成。这些转录因子的相互作用不仅决定了脂肪组织的形成和功能，还受到表观遗传修饰、信号通路和环境因素的调控。然而，以往的研究主要集中在转录和表观遗传层面，对转录后调控机制，特别是lncRNA剪接在畜牧业中的研究仍较为薄弱。

lncRNA是一类长度超过200个核苷酸、通常不具有蛋白质编码能力的RNA分子。它们在脂肪细胞生物学中发挥重要作用，通过调控关键细胞过程，如增殖、分化和脂质代谢，影响脂肪细胞的发育。此外，lncRNA还可以作为微小RNA（miRNA）的分子海绵，通过结合特定miRNA，调节其对下游靶基因的调控作用。miRNA是一种小而保守的非编码RNA分子，长度约为20个核苷酸，通过与靶mRNA的互补序列结合，调控基因表达，从而导致mRNA降解或翻译抑制。同时，lncRNA的剪接能够通过生成不同的剪接变体，进一步调控脂肪组织的发育，并拓展其功能活动。然而，这些剪接变体在反刍动物脂肪生物学中的作用仍缺乏系统研究。

在本研究中，我们鉴定了一种特定的lncRNA剪接事件，命名为与羊脂肪沉积相关的lncRNA（lncRSFD），并系统地探讨了其在脂肪细胞增殖、分化和脂质代谢中的作用。研究发现，lncRSFD的剪接变体在LFTS中表达水平较高，可能与羊脂肪形成密切相关。此外，我们证实lncRSFD具有miRNA海绵的功能，能够影响脂肪生成过程。因此，本研究重点探讨了lncRSFD不同剪接变体及其miRNA调控网络的具体作用，为lncRNA剪接在脂肪生成中的作用提供了新的视角。

为了评估lncRSFD剪接变体（lncRSFD-L和lncRSFD-S）在羊脂肪形成中的作用，我们采用qRT-PCR技术检测了不同组织中lncRSFD剪接变体的表达水平。结果显示，lncRSFD-L在LFTS的肝脏和尾脂肪中表达水平较高，而在TS的肝脏和脾脏中也表现出较高的表达水平。此外，lncRSFD-S在LFTS的肺部、尾脂肪和大网膜中表达水平较高，而在TS的尾脂肪中表达水平较低。这些结果表明，lncRSFD剪接变体的表达水平可能与羊脂肪形成密切相关。

为了进一步验证lncRSFD剪接变体对脂肪细胞增殖和分化的影响，我们进行了qRT-PCR、CCK-8和EdU实验。结果表明，lncRSFD-L和lncRSFD-S的过表达显著促进了脂肪细胞的增殖和活性。其中，qRT-PCR结果显示，PCNA和Cyclin E1的表达水平在lncRSFD-L和lncRSFD-S过表达的3T3-L1细胞中显著增加，而P21的表达水平则显著降低。CCK-8实验进一步表明，lncRSFD-S的过表达显著提高了脂肪细胞的活性，而EdU染色实验显示，lncRSFD-L和lncRSFD-S的过表达显著增加了EdU阳性细胞的数量。这些结果表明，lncRSFD剪接变体在脂肪细胞的增殖过程中发挥重要作用。

此外，我们还评估了lncRSFD剪接变体对脂肪细胞分化和脂质代谢的影响。通过qRT-PCR和油红O染色实验，我们发现lncRSFD-L和lncRSFD-S的过表达显著上调了脂肪生成和脂质代谢相关基因（如PPARγ、C/EBPα、PDK4和FASN）的表达水平，并促进了脂肪细胞中脂滴的积累。这些结果表明，lncRSFD剪接变体不仅促进脂肪细胞的增殖，还对脂肪细胞的分化和脂质代谢具有积极影响。

为了揭示lncRSFD剪接变体与miRNA之间的相互作用机制，我们采用了生物信息学分析和双荧光素酶报告基因实验。结果显示，lncRSFD-L能够直接结合let-7b、miR-3959-3p和miR-323a-5p，而lncRSFD-S则主要结合let-7b和miR-323a-5p。这些miRNA在脂肪细胞增殖和活性方面具有抑制作用，但在脂肪细胞分化和脂质代谢方面具有促进作用。这一发现表明，miRNA在脂肪生成过程中具有双重调控功能，可能通过调节细胞周期和分化过程，实现脂肪形成的动态平衡。

miRNA的双重调控作用可以解释为一种“分化检查点”机制。在脂肪生成的早期阶段，抑制细胞增殖的miRNA活性较低，从而减轻其对细胞周期的抑制，促进前脂肪细胞的增殖和扩展，为后续的分化提供足够的细胞来源。随着脂肪细胞的分化过程，一些与脂肪生成相关的miRNA活性显著增加，从而促进终末分化和脂质沉积。这种动态平衡机制不仅有助于脂肪细胞的正常发育，还可能在调控脂肪代谢方面发挥关键作用。

从生物学角度来看，这种双重调控作用可能反映了脂肪生成过程中的复杂调控网络。许多miRNA具有高度的物种保守性，并通过调控靶mRNA发挥相似的核心生物学功能。例如，exosomal let-7b-5p通过靶向Adrb3基因调节脂肪细胞的功能，而let-7b则结合TGFβR1的3′UTR。此外，miR-323a-5p的靶基因包括CCND1。这些发现与先前的研究结果一致，表明let-7b和miR-323a-5p在脂肪生成中具有重要的调控作用。

综上所述，本研究通过分析lncRSFD的剪接变体及其与miRNA的相互作用，揭示了lncRNA剪接在脂肪生成中的重要作用。我们发现，lncRSFD-L和lncRSFD-S均能促进脂肪细胞的增殖、分化和脂质代谢，但它们对miRNA的结合能力不同，从而可能通过不同的调控机制实现其功能。这一发现不仅加深了我们对脂肪生成调控机制的理解，还为分子育种策略提供了新的思路。通过调控lncRSFD的剪接变体，可能有助于优化羊脂肪沉积模式，提高养殖效率和肉质品质。未来的研究可以进一步探索这些剪接变体在不同羊种中的功能差异，以及它们在脂肪代谢中的具体作用机制，从而为畜牧业的可持续发展提供更全面的理论支持和实践指导。