Hesperetin通过调节肠道微生物群以及通过肠-肺轴影响乙酸和丁酸的水平，从而缓解特发性肺纤维化

《Food Frontiers》：Hesperetin Mitigate Idiopathic Pulmonary Fibrosis by Regulating Gut Microbiota and Acetate and Butyrate Levels via the Gut-Lung Axis

　　本研究通过喂食不同剂量（100, 200 mg/kg/d）的橙皮苷于 bleomycin 诱导的 IPF 小鼠模型，评估其通过肠-肺轴抑制肺纤维化的机制。结果显示，橙皮苷显著改善肺部炎症、胶原沉积和肺动力，同时调节肠道菌群结构（如增加拟杆菌和乳酸杆菌丰度）并提高粪便中短链脂肪酸（SCFAs）水平（如乙酸和丁酸），通过肠-肺轴抑制 IPF 的发展。

　　在当前的后疫情时代和老龄化背景下，特发性肺纤维化（IPF）已成为威胁人类健康的主要疾病之一。作为一种慢性、进行性和异质性的肺部疾病，IPF的发病率和死亡率均较高，且常伴随炎症和肺组织损伤。研究发现，IPF的发病机制与异常的成纤维细胞增殖和细胞外基质（ECM）的过度沉积密切相关，这些过程会导致肺泡上皮细胞被压缩和变形，从而引发肺水肿和充血。尽管IPF的病因尚未完全明确，但普遍认为其发病受到年龄、性别、遗传和生活环境等因素的影响。目前，已批准用于治疗IPF的药物如吡非尼酮和尼达尼布，虽然在一定程度上能够延缓病情进展，但其可能引发的副作用包括胃肠道不适和肝毒性，因此，寻找一种更安全、更有效的治疗策略显得尤为重要。

在此背景下，黄酮类化合物—— hesperetin（橙皮苷）因其多种生物活性，被认为在预防肺部疾病方面具有潜力。hesperetin广泛存在于柑橘类水果及其果皮副产品中，如橙子、柚子和柑橘等。研究表明，hesperetin具有抗氧化、抗炎、抗癌以及治疗神经退行性疾病等作用。已有研究证实，hesperetin能够有效减轻二氧化硅诱导的肺损伤，并缓解多柔比星引起的肺毒性。此外，hesperetin还可能通过AKT/GSK3β信号通路抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖。然而，hesperetin在IPF中的调控作用尚未完全阐明。

近年来，随着对“肠道-肺轴”这一双向联系机制的研究不断深入，越来越多的证据表明肺部疾病与肠道微生物群之间存在密切关联。研究表明，IPF与肠道中某些有害菌如*Helicobacter*和*Desulfovibrio*的丰度增加有关，同时与益生菌如*Lactobacillus*和*Akkermansia*的减少相关。肠道微生物群与肺部之间的交流主要通过循环代谢物如胆汁酸、短链脂肪酸（SCFAs）和色氨酸实现。SCFAs是由膳食纤维经肠道微生物厌氧发酵产生的代谢产物，能够通过血液循环直接作用于肺部，对肺部疾病具有一定的调节作用。例如，有研究发现，口服丁酸可以改善由博来霉素诱导的肺纤维化，通过增强抗炎活性和调控巨噬细胞分化来抑制肺纤维化。此外，丙酸和丁酸也被发现具有预防和修复呼吸上皮屏障功能的作用，为肺部疾病的SCFAs调节提供了理论依据。

然而，目前关于hesperetin如何通过调节肠道微生物群及其SCFAs代谢产物改善IPF的研究仍较为有限。因此，本研究旨在评估hesperetin通过“肠道-肺轴”对博来霉素诱导的IPF在小鼠模型中的影响。通过饮食干预，我们探讨了hesperetin对肺功能、肌成纤维细胞、细胞外胶原蛋白沉积以及抗氧化能力的影响。同时，我们也研究了hesperetin对肠道微生物群和SCFAs的调节作用，并通过相关性分析进一步预测和分析hesperetin依赖“肠道-肺轴”对肠道微生物群的正向调控作用及其对IPF的抑制机制。这项研究不仅为IPF患者提供了饮食指导，也为hesperetin在肺部疾病中的应用提供了理论依据。

在方法部分，我们选择了六周龄的雄性ICR小鼠（*n* = 24）作为实验对象，并在实验开始前将其置于标准环境条件下（温度23 ± 2°C，12小时明暗循环，湿度50 ± 10%）饲养一周，确保其自由获取食物和饮水。hesperetin标准品（纯度≥99.8%）由上海源叶生物科技有限公司提供。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）的《实验室动物护理与使用指南》进行，并获得了浙江省实验动物中心伦理委员会的批准（编号：2023R0006）。参考现有研究的分组方案，实验结束后，将24只小鼠随机分为四组（每组6只），其中三组为模型组和治疗组，另一组为对照组。模型组小鼠通过气管内注射博来霉素硫酸盐（2.5 mg/kg）建立IPF模型，而对照组则接受相同剂量的0.9%生理盐水。在建模完成后，所有小鼠均接受hesperetin的灌胃干预，剂量分别为100和200 mg·kg?1·d?1。建模后，每日进行灌胃干预，持续三周后，小鼠禁食12小时，并接受戊巴比妥钠麻醉。随后，进行肺功能检测和肺组织收集，部分肺组织用于苏木精-伊红（H&E）染色和Masson染色，以观察肺部病理变化；另一部分肺组织则被液氮冷冻并保存在-80°C，用于后续的谷胱甘肽（GSH）、羟脯氨酸（HYP）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）以及胶原蛋白1的分析。同时，收集所有分组小鼠的结肠新鲜粪便样本，用于SCFAs含量测定和肠道微生物群组成分析。

在肺功能检测部分，我们使用戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，暴露其气管并进行气管插管，随后将小鼠连接到强制呼吸系统，测量肺功能指标。主要测量指标包括最大中段呼气流量（MMEF）和潮气量（VT）。这些指标可以反映肺部的运动能力以及小气道的通畅性。结果显示，与模型组相比，hesperetin干预显著提高了小鼠的VT和MMEF，表明其能够有效恢复肺部功能。

在组织病理学和生化分析部分，我们对小鼠肺组织进行了H&E染色和Masson染色，以评估肺部结构的变化和胶原沉积情况。结果显示，模型组小鼠的肺组织表现出明显的病变，如肺泡壁的结缔组织增生、胶原纤维沉积以及巨噬细胞和淋巴细胞的浸润。而hesperetin干预组小鼠的肺组织病变明显减轻，特别是高剂量干预组小鼠的肺部结构恢复得更接近对照组。此外，我们还检测了肺组织中GSH、HYP、MDA和SOD的含量。结果表明，博来霉素显著降低了SOD的活性，并增加了MDA的含量，而hesperetin则能够显著提升SOD和GSH的水平，同时降低MDA的含量。这进一步表明，hesperetin在抑制肺纤维化过程中具有增强抗氧化能力和抗炎作用的潜力。

为了深入研究hesperetin对肠道微生物群的影响，我们进行了16S rRNA基因测序。通过使用CTAB/SDS方法提取小鼠结肠内容物的基因组DNA，并在1%琼脂糖凝胶上检测其浓度和纯度。随后，我们将DNA稀释至1 ng/μL，并送往商业公司（诺维ogene公司）进行测序。测序结果表明，hesperetin能够显著提高肠道微生物群的丰富度和多样性，尤其是通过增加*Lactobacillus*和*Clostridia_UCG_014*等有益菌的丰度，同时降低*Staphylococcus*等有害菌的含量。此外，我们还通过LEfSe分析进一步确认了hesperetin对肠道微生物群的调控作用，结果显示其能够显著改变肠道微生物群的组成，减少有害菌的比例，并增加有益菌的丰度。这一发现支持了hesperetin通过调节肠道微生物群来抑制IPF的假设。

为了评估hesperetin对SCFAs含量的影响，我们使用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）测定小鼠粪便中SCFAs的含量。结果显示，与对照组相比，模型组小鼠的SCFAs水平显著降低，而hesperetin干预能够有效逆转这一趋势。其中，低剂量hesperetin显著提高了醋酸、丙酸和丁酸的含量，而高剂量hesperetin则进一步提升了这些SCFAs的水平。这些结果表明，hesperetin能够通过增加SCFAs的水平，间接改善肺部健康状况。

在进一步的关联分析中，我们研究了SCFAs与肠道微生物群之间的关系。结果表明，SCFAs与肠道微生物群的丰度存在显著的正相关性，而与肺纤维化标志物如α-SMA和胶原蛋白1存在负相关性。尤其是丁酸，其含量的增加与α-SMA和胶原蛋白1的表达水平显著负相关，表明丁酸在抑制肺纤维化过程中具有重要作用。此外，醋酸和丙酸的增加也与肺功能的改善相关，进一步支持了hesperetin通过SCFAs改善肺部健康的机制。

在讨论部分，我们强调了肠道微生物群及其代谢产物在调节全身疾病中的重要性。研究表明，肠道微生物群的失衡与肺部疾病密切相关，表现为有害菌的增加和有益菌的减少，进而影响机体的循环、免疫和代谢系统。因此，调节肠道微生物群已成为预防和治疗肺纤维化的重要手段。此外，SCFAs作为肠道微生物群的重要代谢产物，被广泛认为是连接肠道和肺部功能的关键分子。它们不仅能够调节肠道的免疫功能，还能通过血液循环影响肺部的炎症反应和胶原沉积。

本研究还发现，hesperetin能够显著提高肠道中SCFAs的含量，尤其是醋酸和丁酸，这进一步支持了其通过“肠道-肺轴”改善肺部健康的机制。通过分析hesperetin对肠道微生物群和SCFAs的调节作用，我们发现其能够有效恢复肠道微生物群的平衡，减少有害菌的丰度，并增加有益菌的比例。这一过程可能通过增强SCFAs的生成，从而对肺部产生保护作用。此外，我们还发现hesperetin对肺部的保护作用呈现剂量依赖性，高剂量干预效果更为显著。

尽管本研究提供了hesperetin在IPF治疗中的潜在价值，但我们也认识到一些局限性。例如，未进行粪便微生物移植实验，因此无法完全排除hesperetin对肺部的直接作用。此外，缺乏对血液中SCFAs水平及其在肺部作用靶点的研究，使得我们无法直接验证SCFAs对肺纤维化的抑制作用。未来的研究可以进一步探讨这些方面，以更全面地理解hesperetin的治疗机制。

综上所述，本研究揭示了hesperetin通过调节肠道微生物群和增加SCFAs水平，对IPF具有显著的抑制作用。这一发现不仅为hesperetin在肺部疾病中的应用提供了新的思路，也为开发基于天然产物的治疗策略提供了理论支持。未来的研究应进一步探索hesperetin在人体中的作用机制，并评估其在临床中的应用前景。