HMOX1通过与BNIP3相互作用经线粒体自噬途径调控脊髓缺血再灌注损伤后神经元铁死亡

《Cell Death Discovery》：HMOX1 interacts with BNIP3 to modulate neuronal ferroptosis after spinal cord ischemia-reperfusion injury via a mitophagy-dependent mechanism

　　本刊推荐：针对脊髓缺血再灌注损伤(SCIRI)后神经细胞死亡机制不明的难题，本研究聚焦铁死亡(ferroptosis)这一新型细胞死亡方式。研究人员通过体内外实验证实，血红素加氧酶1(HMOX1)通过结合线粒体自噬受体BNIP3，过度激活线粒体自噬(mitophagy)，进而促进神经元铁死亡。干预HMOX1-BNIP3轴可显著改善神经功能，为SCIRI治疗提供了新靶点。

　　

当脊髓遭遇缺血再灌注损伤，一场隐秘的细胞死亡事件正在悄然发生。脊髓缺血再灌注损伤(SCIRI)是创伤、脊髓减压和胸腹主动脉手术后常见的严重并发症，常导致永久性感觉运动功能障碍甚至瘫痪。尽管临床意义重大，但其背后的细胞分子机制尚未完全阐明，特别是近年来发现的铁死亡(ferroptosis)——一种铁依赖性的调节性细胞死亡方式，是否参与其中仍是一个谜。

铁死亡以其独特的死亡特征区别于凋亡和坏死：细胞内脂质过氧化物累积、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)活性抑制、以及铁代谢异常。在脑缺血、肝损伤等疾病中，铁死亡已被证实是关键损伤机制，但在SCIRI中的具体作用和调控网络仍有待揭示。更令人困惑的是，细胞内重要的应激蛋白血红素加氧酶1(HMOX1)在氧化应激中扮演着"双刃剑"角色——既能通过分解血红素产生抗氧化物质发挥保护作用，又能释放游离铁离子促进氧化损伤。这种矛盾特性使得HMOX1在SCIRI中的确切功能需要深入探讨。

兰州大学第二医院康学文教授团队在《Cell Death Discovery》上发表的最新研究，正是针对这一科学问题展开的系统性探索。研究人员发现，在SCIRI发生后，HMOX1表达显著上调，且与铁死亡标志物变化密切相关。通过基因敲低和过表达实验，他们证实HMOX1是促进神经元铁死亡的关键调节因子。更有趣的是，HMOX1并非孤立作战，而是与线粒体自噬受体BNIP3形成蛋白质相互作用复合物，共同调控线粒体自噬过程。适度的线粒体自噬本是细胞的自我保护机制，可清除受损线粒体维持稳态，但HMOX1-BNP3轴驱动的过度线粒体自噬却成为"帮凶"，通过释放大量铁离子而加剧铁死亡。这一发现不仅揭示了SCIRI的新机制，也为治疗干预提供了新的靶点。

研究人员综合运用了多种关键技术方法：通过大鼠SCIRI模型和PC12细胞氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型模拟临床病理过程；利用免疫共沉淀联合质谱分析(IP/MS)筛选HMOX1相互作用蛋白；采用慢病毒载体进行基因敲低和过表达操作；通过Western blotting、免疫荧光、qRT-PCR等技术检测蛋白和基因表达；使用JC-1染色评估线粒体膜电位，FerroOrange和C11 BODIPY探针检测铁离子和脂质过氧化水平；并借助透射电镜观察自噬体形成。动物实验方面，研究使用SD大鼠建立SCIRI模型，通过椎管内注射慢病毒进行干预，采用BMS评分和神经电生理监测评估神经功能恢复。

Ferroptosis在SCIRI大鼠模型中的发生与HMOX1表达上调

研究人员首先在动物水平证实了铁死亡在SCIRI过程中的关键作用。Western blotting结果显示，随着缺血再灌注时间延长，铁死亡正调控因子ACSL4表达上升，而负调控因子FTH1和GPX4表达下降。同时，脂质过氧化产物MDA水平显著增加，抗氧化物质GSH含量降低，这些典型的铁死亡生物标志物变化表明铁死亡确实参与了SCIRI的病理过程。值得注意的是，HMOX1在mRNA和蛋白水平的表达均随时间推移而上调，在再灌注48小时达到峰值，提示HMOX1可能在这一过程中扮演重要角色。

OGD/R模型中铁死亡的发生与HMOX1表达增加

为验证体内结果，研究团队在PC12细胞中建立了OGD/R模型。结果显示，随着OGD时间延长，细胞活力显著下降，细胞内Fe²⁺和脂质过氧化水平明显升高，同时ACSL4表达上调而GPX4和FTH1表达下降，这些变化与动物实验结果一致，证实OGD/R可诱导神经元细胞发生铁死亡。同样，HMOX1在OGD/R处理后表达显著增加，在剥夺6小时复氧24小时后达到峰值，进一步支持了HMOX1与铁死亡的相关性。

2+ and lipid peroxidation levels(n=6). L, M The relative values of MDA and GSH concentrations were determined(n=6).N-P Western blotting and qRT-PCR analysis of HMOX1 protein and mRNA expression(n=3).Q Immunofluorescence analysis of HMOX1 expression(n=6). Compared with the control group,P<0.05,P<0.01,**P<0.001.'>

HMOX1上调促进铁死亡

为明确HMOX1在铁死亡中的因果关系，研究人员通过慢病毒载体敲低或过表达HMOX1。结果显示，HMOX1敲低可显著减轻OGD/R和铁死亡诱导剂Erastin引起的铁死亡，表现为ACSL4表达下降，GPX4和FTH1表达上升，MDA水平降低，GSH水平升高，细胞内Fe²⁺和脂质过氧化减少。相反，HMOX1过表达则加重了铁死亡表型。这些结果直接证明HMOX1是铁死亡的正向调节因子。

2+ and lipid peroxidation(n=6).P<0.05,P<0.01,**P<0.001.'>

HMOX1与BNIP3的相互作用

为探索HMOX1调控铁死亡的机制，研究采用免疫共沉淀联合质谱分析(IP/MS)筛选HMOX1的相互作用蛋白，发现线粒体自噬受体BNIP3与HMOX1存在直接结合。Co-IP实验进一步验证了两者在生理条件和OGD/R处理下均能相互作用，且在OGD/R后结合增强。同时，HMOX1的表达水平可正向调控BNIP3蛋白量，提示二者可能形成功能复合物。

HMOX1诱导的铁死亡与线粒体自噬激活相关

鉴于BNIP3是关键的线粒体自噬受体，研究进一步探讨了线粒体自噬在HMOX1诱导铁死亡中的作用。结果显示，HMOX1过表达可激活线粒体自噬流，表现为LC3II增加、P62降解、线粒体标志蛋白TOMM20和COXIV减少、线粒体膜电位下降、自噬体增多。相反，HMOX1敲低则抑制线粒体自噬。线粒体自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin)和抑制剂mdivi-1可分别逆转HMOX1敲低和过表达的效果，证实HMOX1通过调节线粒体自噬影响铁死亡。

BNIP3过表达逆转HMOX1敲低对铁死亡的抑制作用

为验证HMOX1-BNIP3轴的功能重要性，研究在HMOX1敲低的基础上过表达BNIP3。结果显示，BNIP3过表达可挽救HMOX1敲低对线粒体自噬和铁死亡的抑制作用，而mdivi-1处理可阻断这一效应。特别值得注意的是，铁螯合剂DFO可抑制BNIP3过表达引起的铁死亡，但不影响BNIP3和LC3II表达，表明线粒体通过释放铁参与铁死亡过程。Mito-FerroGreen检测进一步证实BNIP3过表达可增加线粒体内Fe²⁺水平。

2+ levels and lipid peroxidation levels(n=6).P<0.05,P<0.01,**P<0.001.'>

HMOX1敲低促进SCIRI后神经功能恢复

在体实验显示，椎管内注射LV-shHMOX1可有效降低损伤区HMOX1表达，显著改善SCIRI大鼠的运动功能(BMS评分)和感觉运动诱发电位(SEP/MEP)。组织学分析表明，HMOX1敲低减轻了脊髓组织损伤、神经元丢失和脱髓鞘现象。同时，凋亡抑制剂Z-VAD-FMK处理不影响铁死亡相关蛋白表达，说明HMOX1诱导的铁死亡不依赖于凋亡途径。

HMOX1敲低抑制SCIRI大鼠的铁死亡和过度线粒体自噬

最后，研究证实HMOX1敲低可显著抑制SCIRI后的铁死亡，表现为ACSL4下调，FTH1和GPX4上调。同时，BNIP3表达下降，LC3II/LC3I比率降低，P62和TOMM20积累，表明过度线粒体自噬受到抑制。这些结果在体内验证了HMOX1通过BNIP3介导的线粒体自噬途径调控铁死亡的机制。

本研究系统阐明了HMOX1-BNIP3轴通过调控线粒体自噬在SCIRI后神经元铁死亡中的核心作用。传统观点认为HMOX1主要发挥细胞保护作用，但本研究揭示其在特定病理条件下通过促进铁死亡加重神经损伤。创新性地发现HMOX1与BNIP3的直接相互作用，并证实这种相互作用是过度线粒体自噬和铁死亡的关键分子事件。

研究的意义在于：理论上，丰富了SCIRI的细胞分子机制，建立了HMOX1-线粒体自噬-铁死亡的信号轴，为理解不同条件下HMOX1功能转换提供了新视角；实践上，HMOX1-BNIP3轴作为SCIRI的潜在治疗靶点，为开发神经保护策略提供了新方向。然而，研究也存在局限性，如缺乏人脊髓组织验证、OGD/R模型不能完全模拟体内复杂微环境等，未来需要进一步探讨HMOX1-BNIP3相互作用的具体结构基础及其调控机制。

总之，这项研究不仅深化了对SCIRI病理机制的认识，也为相关神经系统疾病的治疗提供了新思路。针对HMOX1-BNIP3轴的干预可能成为预防和治疗SCIRI的新策略，具有重要的临床转化价值。