Shank3在小脑苔藓纤维-颗粒细胞突触中决定了AMPA受体亚基的组成，并与区域性小胶质细胞形态的改变有关

《Neurobiology of Disease》：Shank3 establishes AMPA receptor subunit composition at cerebellar mossy fiber-granule cell synapses and is associated with altered regional microglial morphology

　　本研究通过电生理记录和免疫组化方法，发现Shank3基因缺失导致小鼠小脑颗粒细胞（CGCs）中突触谷氨酸受体（AMPAR）介导的兴奋性突触传递增强，表现为钙通透性AMPAR（CP-AMPAR）比例增加和突触响应动力学改变，同时微胶质细胞形态出现重塑。这些发现揭示了Shank3在小脑突触成熟和功能稳态中的关键作用，并可能为自闭症谱系障碍（ASD）的病理机制提供新视角。

　　本研究聚焦于一个在神经发育障碍中具有重要意义的基因——Shank3，探索其在小脑颗粒细胞（CGCs）中的作用，尤其是在小脑-小脑颗粒细胞（MF-CGC）突触功能方面的具体影响。Shank3基因的突变是Phelan-McDermid综合征（PMS）的主要遗传原因，而PMS常与自闭症谱系障碍（ASD）共存。Shank3是一种重要的突触后支架蛋白，通过与AMPA受体（AMPAR）、NMDA受体（NMDAR）和代谢型谷氨酸受体（mGluRs）相互作用，调节兴奋性谷氨酸能突触功能。尽管已有大量研究探讨了Shank3在大脑前部区域中的作用，但对于其在小脑中的角色，尤其是在小脑在ASD病理机制中的重要性不断上升的背景下，了解尚不充分。因此，本研究旨在分析Shank3缺失如何影响MF-CGC突触的谷氨酸能突触功能，以及它是否影响小脑皮层的局部支持细胞形态和CGC密度。

研究通过使用体外小脑脑片，采用全细胞膜片钳记录技术，记录了CGCs的微型、诱发和光激活的谷氨酸能反应。同时，利用免疫组化技术分析了AMPAR亚基（如GluA2和GluA4）的表达情况以及小胶质细胞的形态变化。研究发现，在缺乏Shank3的情况下，CGCs的量子mEPSC振幅和AMPAR介导的光激活反应显著增加。这表明，Shank3的缺失可能影响了AMPAR在突触后膜上的分布或功能特性。此外，诱发的EPSC在Shank3缺失的小鼠中表现出更快的AMPAR衰减动力学、内向整流现象以及对IEM-1460的更高敏感性，这些发现表明MF-CGC突触中可能存在大量具有独特生物物理特性的CP-AMPAR。同时，小脑颗粒体区附近的GluA2密度减少，与电生理结果一致。此外，Shank3缺失的小鼠表现出小胶质细胞分支减少，提示小脑皮层的小胶质细胞形态在成年早期发生了变化。

本研究的结果揭示了Shank3在维持MF-CGC突触中CP-AMPAR和CI-AMPAR之间的平衡中的关键作用，这对于突触成熟和小脑回路功能至关重要。Shank3缺失导致的这种平衡失调，可能与小脑相关的行为缺陷有关，并可能成为ASD病理生理学的一部分。此外，研究还探讨了小胶质细胞形态变化与突触功能异常之间的潜在联系，提出了Shank3缺失可能导致突触后钙离子渗透性增加，从而引发小胶质细胞的激活或形态改变，进一步影响小脑功能。

在方法部分，研究采用了一系列严格的实验流程，包括动物处理、小脑切片制备、全细胞膜片钳记录、微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）分析、诱发的兴奋性突触后电流（eEPSCs）测量、光激活的谷氨酸释放实验以及小胶质细胞形态的免疫组化分析。实验过程中，研究人员首先确认了小鼠的基因型，然后在成年（4-6个月）小鼠中进行实验。通过使用特定的记录电极和溶液，研究人员能够精确地测量突触后电流的变化，并利用数据分析软件进行处理和统计学分析。

研究结果部分展示了Shank3缺失对MF-CGC突触功能的具体影响。首先，通过mEPSCs的记录，发现Shank3缺失的小鼠在突触后AMPAR功能方面有显著增强，而突触前的谷氨酸释放未受影响。接着，通过eEPSCs的记录，进一步验证了这一发现，发现尽管AMPAR和NMDAR的响应幅度相似，但AMPAR的衰减速度更快，这可能与AMPAR亚基组成的变化有关。此外，光激活的谷氨酸释放实验也显示，Shank3缺失导致AMPAR介导的反应显著增强，这可能与AMPAR数量的增加或其生物物理特性的改变有关。进一步的分析表明，Shank3缺失可能影响了CP-AMPAR的表达比例，导致其在突触后膜的富集，从而影响突触功能和神经元的兴奋性。

研究还探讨了小胶质细胞形态变化与突触功能异常之间的关系。发现Shank3缺失的小鼠小胶质细胞的表面面积减少，这可能与小胶质细胞的功能状态变化有关。研究推测，这种形态变化可能是由于突触功能异常引发的钙离子渗透性增加，进而触发小胶质细胞的激活。然而，这种形态变化是否直接导致突触功能异常，还需要进一步的研究来确认。

研究的讨论部分深入分析了Shank3在不同脑区和突触类型中的作用差异。尽管Shank3在小脑颗粒细胞中高度表达，但其缺失对突触前谷氨酸释放的影响可能因脑区和发育阶段的不同而异。此外，研究还指出，Shank3与AMPAR亚基（如GluA2）的相互作用可能通过与GRIPs和PICK1等蛋白的结合，影响AMPAR的运输和定位。这种机制可能在突触成熟过程中起关键作用，从而影响突触功能和神经元兴奋性。

研究的结论部分强调了Shank3在小脑中的作用可能被低估。尽管已有大量研究关注其在前脑区域的作用，但小脑中的具体机制仍需进一步探索。研究发现，Shank3的缺失主要影响突触后功能，而非突触前释放。这种影响可能与突触后AMPAR的组成变化有关，从而导致突触成熟障碍和小脑回路功能异常。此外，小胶质细胞形态的变化可能反映了突触功能异常的后果，但具体的因果关系仍需进一步研究。

研究还提到了作者的贡献和研究资助信息。Rajaram Kshetri负责撰写和分析实验数据，Raheem F.H. AI Aameri参与了免疫组化数据的收集和分析，Ben D. Richardson负责项目设计和最终论文的审阅。研究得到了美国国家心理健康研究所（NIMH）的资助，这为后续研究提供了重要的支持。

总的来说，这项研究为理解Shank3在小脑中的作用提供了新的视角，揭示了其在维持突触功能和小脑回路平衡中的关键角色。研究结果不仅有助于解释ASD的病理机制，也为未来开发针对小脑相关症状的治疗方法提供了理论依据。同时，研究还强调了小胶质细胞在小脑病理中的潜在作用，提示其形态变化可能与突触功能异常有关。未来的研究需要进一步探讨Shank3在不同脑区和发育阶段的具体作用，以及其与小胶质细胞相互作用的详细机制。