PAM-readID：一种用于哺乳动物细胞中CRISPR-Cas酶PAM识别的快速、简便且精准的新方法

《Communications Biology》：PAM-readID is a rapid, simple, and accurate PAM determination method for CRISPR-Cas enzymes in mammalian cells

　　本研究针对哺乳动物细胞中CRISPR-Cas核酸酶的原间隔序列邻近基序（PAM）识别谱鉴定技术复杂、难以广泛应用的难题，开发了名为PAM-readID的新型体内PAM测定方法。该方法通过双链寡脱氧核苷酸（dsODN）整合至DNA双链断裂位点，成功鉴定了SaCas9、SpCas9、AsCas12a等多种CRISPR-Cas核酸酶在哺乳动物细胞中的PAM偏好，包括非经典PAM（如SaCas9的NNAAGT、SpCas9的NGT）。该方法仅需极低测序深度（500 reads）即可获得准确结果，并可基于Sanger测序进行低成本分析，为基因治疗和医学研究中CRISPR工具的优化与应用提供了重要技术支撑。

　　

在基因组编辑领域，CRISPR-Cas系统如同一把精准的分子剪刀，但其切割活性受到原间隔序列邻近基序（PAM）的严格限制。同一Cas核酸酶在不同工作环境（如体外、细菌细胞或哺乳动物细胞）中展现的PAM识别谱存在显著差异，而哺乳动物细胞中的PAM鉴定方法长期以来依赖荧光报告系统和流式细胞分选技术，操作复杂、耗时费力，严重阻碍了新型基因编辑工具的开发和临床应用。这一技术瓶颈使得研究人员亟需一种能够在哺乳动物细胞中快速、简便且准确测定PAM识别谱的方法。

为解决这一问题，杭州师范大学的王秋艳、谢天等研究人员在《Communications Biology》上发表了题为“PAM-readID is a rapid, simple, and accurate PAM determination method for CRISPR-Cas enzymes in mammalian cells”的研究论文，开发了一种名为PAM-readID（PAM REcognition-profile-determining Achieved by Double-stranded oligodeoxynucleotides Integration in DNA double-stranded breaks）的新方法。该方法巧妙地利用双链寡脱氧核苷酸（dsODN）在CRISPR-Cas切割产生的DNA双链断裂位点进行整合，通过阳性选择策略直接捕获被识别的PAM序列。

研究团队构建了包含随机PAM库的质粒，将其与表达Cas核酸酶和sgRNA的质粒以及dsODN共同转染至人胚肾细胞（HEK293T）中。Cas核酸酶在细胞内切割带有可识别PAM的靶序列后，细胞通过非同源末端连接（NHEJ）修复途径将dsODN整合到断裂位点。72小时后提取基因组DNA，使用dsODN标签特异性引物和靶质粒特异性引物进行PCR扩增，从而富集含有被识别PAM的切割产物。扩增产物可通过高通量测序（HTS）或Sanger测序进行分析。

研究人员对SaCas9、Nme1Cas9、SpCas9、SpG、SpRY和AsCas12a等多种CRISPR-Cas核酸酶进行了PAM-readID分析。 indel分析显示，对于Cas9（如SaCas9和SpCas9），绝大多数（约99%）的修复产物仅为dsODN整合，未伴随侧翼缺失，PAM序列保持完整，适合后续分析。而AsCas12a由于产生5'突出末端，其修复产物中dsODN整合常伴随不同大小的缺失（1-20 bp），超过50%的序列仍保留完整PAM。

通过序列标识图和热图分析，PAM-readID成功揭示了这些核酸酶在哺乳动物细胞中的PAM识别特征。SaCas9偏好NNGRRN PAM，并发现了非经典PAM如NNAAGT和NNAGGT。嵌合体核酸酶SaHyCas9显示出对NNAAAA PAM的偏好。Nme1Cas9的PAM谱为N₄GATT，但第六、七、八位点的灵活性高于体外测定结果。SpCas9主要识别NGG PAM，同时对NAG和NGA有较低耐受，并发现了非经典PAM NGT和NTG。SpG偏好NRN PAM，而SpRY对NYN（Y代表C或T）表现出更宽松的识别能力。AsCas12a则典型地识别TTTV PAM。

值得注意的是，PAM-readID作为一种阳性选择方法，所需测序深度极低。对于SpCas9，仅需500条reads即可构建准确的PAM标识图；SaCas9需100条；AsCas12a仅需10条。此外，研究还开发了基于Sanger测序的替代方案：将dsODN整合的PCR产物克隆至载体中，扩增长约800 bp的片段，通过EditR软件分析测序色谱图的合并峰，计算PAM各位点碱基比例，从而生成序列标识图。该方法成功应用于SaCas9、SpCas9、SpG和SpRY的PAM分析，结果与HTS高度一致。

该研究还比较了PAM-readID与体外方法HT-PAMDA的结果，发现SpG和SpRY在哺乳动物细胞中对Y（C/T）的耐受性在HT-PAMDA中未能充分体现，凸显了体内PAM测定对于反映真实生物学环境的重要性。

综上所述，PAM-readID作为一种不依赖荧光报告系统和流式细胞分选技术的体内PAM测定方法，具有快速、简便、准确、成本低的显著优势。它能够精准揭示CRISPR-Cas核酸酶在哺乳动物细胞中的PAM识别谱，包括非经典PAM，且对SpCas9等酶仅需极低测序深度。该方法基于Sanger测序的简化方案进一步降低了技术门槛和成本。PAM-readID有望广泛应用于新型Cas9直系同源物和工程化Cas9核酸酶的PAM表征，特别是在基因治疗和医学研究领域，将加速CRISPR-Cas系统的探索和优化进程，推动基因组编辑技术的发展。