植物乳杆菌复合发酵芥菜：代谢组学揭示风味提升与安全性调控新机制

《BMC Microbiology》：Physicochemical properties and differential metabolites associated with mustard fermentation by Pediococcus pentosaceus and Lactiplantibacillus pentosus compound

　　本研究针对传统自然发酵芥菜存在发酵周期长、亚硝酸盐安全隐患及风味不稳定等问题，采用从南宁传统酸菜中分离的戊糖片球菌M52和戊糖乳植杆菌H1进行复合接种发酵。研究发现，在接种量1%、菌种比例2:1的最佳条件下，复合发酵显著提升了乳酸含量(pH快速降低)，完全抑制了亚硝酸盐积累(峰值降低至26.77 mg/kg以下)，并通过非靶向代谢组学鉴定出206种显著差异代谢物，包括21种上调氨基酸类物质和13种上调苯环衍生物。该研究为乳酸菌复合发酵蔬菜的标准化生产提供了理论依据和技术支撑。

　　

在中国传统饮食文化中，发酵蔬菜食品以其爽脆口感、独特风味和促消化特性备受青睐。其中，芥菜作为十字花科重要蔬菜品种，在广西壮族自治区种植面积已达5.3万公顷，是当地重要的经济作物。然而，芥菜喜凉爽环境、播种期短、采摘后需冷藏储存等特点限制了其产业发展。传统自然发酵虽然能延长芥菜保质期，但存在发酵周期长、产品安全性和稳定性不可控等问题，特别是亚硝酸盐积累可能带来致畸、致癌、致突变风险。研究表明，亚硝酸盐摄入量超过0.2-0.5克可能导致中毒，超过3克则有死亡风险。

为解决这些问题，研究人员将目光投向乳酸菌(LAB)接种发酵技术。乳酸菌能够分解碳水化合物产生乳酸，抑制有害微生物生长，同时产生芳香化合物提升食品感官品质。然而单一菌种发酵难以完成复杂的生化反应过程，复合接种可通过协同作用促进更多样化代谢产物的生成。在此背景下，广西民族大学的研究团队从南宁市西乡塘区罗文农产品市场采集传统自然发酵酸菜样品，分离筛选出两株高产酸乳酸菌——戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus M52和戊糖乳植杆菌Lactiplantibacillus pentosus H1，系统研究其复合接种对芥菜发酵品质的改善作用。

研究人员首先通过形态学观察和分子生物学鉴定确认菌株特性。如图1所示，M52菌株在MRS培养基上形成圆形乳白色菌落，扫描电镜显示为球形结构，革兰氏染色阳性；H1菌株菌落呈白色湿润状，电镜下为短杆状（图2）。16S rRNA系统发育树分析（图3）进一步证实M52与Pediococcus pentosaceus、H1与Lactiplantibacillus pentosus分别聚于同一分支。通过优化发酵条件发现，当接种量为1%、菌种比例为2:1时，发酵体系pH值最低而总酸含量最高（图4），确定为最佳发酵参数。

关键技术方法包括：1）从南宁传统发酵酸菜中分离纯化乳酸菌株；2）通过单因素实验优化接种量(0.5%-2.0%)和接种比例(1:1-3:1)；3）采用国标方法测定pH、总酸、乳酸、亚硝酸盐和葡萄糖等理化指标；4）运用超高效液相色谱-轨道阱质谱(UHPLC-Orbitrap)进行非靶向代谢组学分析，通过XCMS软件提取质谱峰，采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)筛选差异代谢物(VIP>1且P<0.05)；5）利用KEGG数据库进行代谢通路富集分析。

理化特性分析

通过对比自然发酵、单菌接种发酵和复合接种发酵体系的理化指标变化，发现复合接种发酵组pH值下降速度显著快于其他两组(图5A)，最终pH值明显低于自然发酵组(P<0.001)。总酸含量在整个发酵过程中始终维持较高水平(图5B)，表明复合接种能加速酸化进程，缩短发酵时间。乳酸含量测定结果(图6A)显示复合发酵组显著高于其他两组(P<0.001)，与总酸变化趋势一致。尤为重要的是，复合接种完全抑制了亚硝酸盐积累(图6B)，其浓度始终低于检测限，而自然发酵组在第5天出现26.77 mg/kg的峰值。葡萄糖消耗实验(图6C)表明复合接种组在第3天即接近完全消耗，说明菌株协同作用提高了底物利用效率。

代谢组学分析

主成分分析(PCA)显示自然发酵组(CK)与复合接种组(EG)明显分离(图7A)，OPLS-DA模型验证了组间差异的可靠性(图7B)，置换检验证实模型未过拟合(图7C)。共鉴定出8169种代谢物，其中羧酸及其衍生物占比最高(16.46%)，未定义化合物(11.91%)和有机氧化合物(11.71%)次之(图8)。通过VIP>1和P<0.05标准筛选出206种显著差异代谢物，正离子模式下鉴定139种(80种上调、59种下调)，负离子模式下鉴定67种(图9)。聚类热图显示两组代谢物表达模式存在明显差异(图10)。

差异代谢物鉴定

如表1所示，氨基酸、肽及类似物(28种)、碳水化合物及糖缀合物(25种)、苯环及取代衍生物(22种)变化最为显著。21种氨基酸类物质显著上调，包括D-天冬酰胺、DL-谷氨酸、DL-组氨酸和赖氨酸等风味前体物质。碳水化合物中18种显著下调，如D-甘露糖、α-D-葡萄糖和蔗糖，与葡萄糖消耗实验结果一致。13种苯环衍生物上调，包括具有抗菌作用的氨苯砜、抗炎抗癌的龙胆酸以及广谱抗真菌药物伏立康唑。此外，91种挥发性风味物质发生显著变化(表2)，包括4种醇类、47种酸类、11种酮类和17种酚类物质，其中(-)-α-海人草酸、2-羟基-2-甲基丁酸和反式-3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂醛等显著上调，共同提升了发酵芥菜的风味复杂度。

代谢通路富集

KEGG分析显示差异代谢物主要富集于ABC转运蛋白、半乳糖代谢、磷酸转移酶系统(PTS)、氨基酸生物合成、核苷酸代谢和次级代谢物合成等通路(图12A)。特别值得注意的是，维生素C(抗坏血酸)、3'-单磷酸腺苷和反式阿魏酸等营养物质显著增加，而D-甘露糖、D-果糖等糖类物质减少(图12B)。维生素C作为抗氧化剂和免疫增强剂，其含量提升有助于降低亚硝酸盐风险；3'-单磷酸腺苷可通过激活cAMP信号通路调节代谢；反式阿魏酸则具有抗炎、抗衰老等多重生物活性。抗坏血酸代谢通路分析(图12C)表明葡萄糖的高效转化促进了维生素C合成，进而提升产品安全性。

本研究通过复合接种戊糖片球菌M52和戊糖乳植杆菌H1，成功解决了传统芥菜发酵周期长、安全性差的技术瓶颈。代谢组学分析揭示了菌株协同作用通过调控ABC转运蛋白、氨基酸生物合成等代谢通路，显著提升风味物质和营养成分的机制。该研究不仅为复合乳酸菌发酵蔬菜的标准化生产提供了关键技术参数，也为通过微生物代谢工程改善传统食品品质提供了新思路。未来研究可进一步解析特定代谢物合成的分子调控网络，为精准调控发酵过程提供理论支撑。