基于CRISPR/Cas13a的比色生物传感平台，用于即时检测病毒核酸

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：CRISPR/Cas13a-based colorimetric biosensing platform for point-of-care detection of viral nucleic acids

　　CRISPR/Cas13a结合G4/hemin DNAzyme开发无标记颜色指示平台，实现登革热病毒和SARS-CoV-2的高灵敏特异性POC检测，可区分登革四血清型，检测限达attomolar级。

　　病毒检测是公共卫生领域的一项重要任务，特别是在应对传染病爆发时，快速、准确和高效的诊断手段对于控制疾病传播和改善患者预后具有关键意义。随着生物技术的不断发展，CRISPR/Cas13a系统因其高特异性、高灵敏度以及在分子诊断中的广泛应用而备受关注。然而，传统的CRISPR/Cas13a诊断平台通常依赖于荧光探针或侧向流动检测方法，这些方法在实际应用中存在一定的局限性，例如需要复杂的光学设备、繁琐的标记步骤以及可能的假阳性信号问题。因此，开发一种更加简便、经济且高灵敏度的病毒检测方法成为研究的重点。

本研究提出了一种基于CRISPR/Cas13a系统的新型无标记、可视化检测平台，称为“颜色SHERLOCK”（Colorimetric SHERLOCK）。该平台利用了鸟嘌呤四联体（G4）与血红素（hemin）结合形成DNA酶的特性，实现了对登革病毒（DV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的快速、准确和灵敏检测。与传统方法相比，这种新的检测策略不仅消除了对昂贵光学设备和复杂标记步骤的依赖，还通过信号级联放大机制显著提升了检测性能，使得结果能够通过肉眼直接观察，大大提高了检测的便捷性和可及性。

登革病毒是一种通过蚊子传播的RNA病毒，具有多种血清型，能够在全球范围内引发大规模的疫情。SARS-CoV-2则是导致新冠疫情的病毒，其传播速度和影响范围远超以往的病毒爆发。这两种病毒的检测对于公共卫生管理至关重要，尤其是在资源有限的地区，需要一种快速、经济且无需复杂设备的检测手段。本研究选择DV和SARS-CoV-2作为检测目标，是因为它们在公共卫生领域具有极高的关注度，且存在较高的检测需求。

在传统的SHERLOCK平台中，检测通常依赖于荧光探针或侧向流动技术，这两种方法虽然在灵敏度方面表现优异，但都存在一定的不足。荧光探针方法需要使用昂贵的荧光标记物和复杂的仪器设备，这在基层医疗机构或资源匮乏的地区难以推广。而侧向流动检测虽然操作简便，但其检测结果可能受到流动速率控制不当的影响，导致假阳性结果的出现。因此，开发一种无需标记且能够通过颜色变化直观呈现检测结果的平台，对于提升病毒检测的普及性和实用性具有重要意义。

本研究中的颜色SHERLOCK平台通过将CRISPR/Cas13a系统与G4/hemin DNA酶结合，构建了一种无标记、可视化的信号放大机制。G4结构是由富含鸟嘌呤的DNA链自组装形成的，而血红素则能够激活这种结构，使其表现出类似于过氧化物酶的催化活性。当目标病毒RNA被CRISPR/Cas13a系统识别并触发非特异性切割反应时，释放出的RNA片段能够激活G4/hemin DNA酶，进而催化过氧化氢（H?O?）与2,2′-联氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二钠盐（ABTS2?）的反应，生成肉眼可见的绿色产物（ABTS•?）。这一过程不仅实现了信号的放大，还确保了检测的高灵敏度和高特异性。

与传统的SHERLOCK平台相比，颜色SHERLOCK平台在多个方面进行了优化。首先，它消除了对荧光探针的依赖，使得检测过程更加简便，无需复杂的仪器设备。其次，该平台通过信号级联放大机制，进一步提升了检测的灵敏度，使其能够在较低的病毒浓度下实现准确识别。此外，颜色变化的检测方式使得结果更加直观，便于非专业人员操作和解读。这些改进使得颜色SHERLOCK平台在实际应用中更具优势，尤其是在现场快速检测（point-of-care, POC）场景中。

为了验证该平台的性能，研究团队进行了多种实验，包括对细胞培养的DV样本、临床DV样本以及SARS-CoV-2样本的检测。实验结果显示，颜色SHERLOCK平台不仅能够有效识别这两种病毒，还能区分DV的四种血清型，检测灵敏度和特异性均达到了与逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）相当的水平。这表明，该平台在病毒检测的准确性方面具有良好的表现，同时在操作便捷性和成本效益方面也表现出色。

此外，研究团队还对平台的稳定性、重复性和实际应用可行性进行了评估。实验表明，该平台在不同温度和湿度条件下均能保持较高的检测性能，且重复性良好，能够满足现场检测的需求。这些特性使得颜色SHERLOCK平台不仅适用于实验室环境，也适用于现场快速检测，尤其是在偏远地区或资源有限的医疗机构中。

在实际应用中，颜色SHERLOCK平台的简便性和可视化特性使其成为一种理想的病毒检测工具。它不需要复杂的操作流程或昂贵的设备，因此可以广泛应用于各种场合，包括医院、社区卫生中心、检疫站点等。这种检测方法的普及将有助于提高病毒检测的覆盖率，尤其是在疫情高发地区或突发公共卫生事件中，能够快速提供检测结果，为疫情防控提供有力支持。

研究团队还强调了该平台在公共卫生领域的潜在应用价值。通过结合CRISPR/Cas13a系统和G4/hemin DNA酶，颜色SHERLOCK平台能够在不牺牲检测性能的前提下，实现更低成本、更便捷的操作。这种技术的推广将有助于提升基层医疗机构的诊断能力，减少对高成本设备的依赖，同时提高检测的可及性和实用性。

总之，颜色SHERLOCK平台的开发为病毒检测提供了一种全新的解决方案。它不仅在技术上实现了创新，还在实际应用中展现出显著的优势。通过无标记、可视化、信号级联放大等策略，该平台能够有效提升病毒检测的灵敏度和特异性，同时降低检测成本和操作难度。这种技术的进步将有助于推动精准医学的发展，为全球公共卫生体系提供更加可靠和高效的诊断工具。