基于分泌途径遗传工程改造缓解酵母内质网应激以增强重组卵清蛋白生产

《FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY》：Alleviation of ER stress via targeted genetic engineering enhances recombinant ovalbumin secretion in Saccharomyces cerevisiae

　　本研究针对酿酒酵母分泌重组卵清蛋白（OVA）过程中存在的内质网（ER）应激和囊泡运输效率低下的问题，通过系统改造14个分泌途径相关基因，发现PAH1基因敲除可通过促进ER膜生物发生使OVA分泌量提升74%（达5.68 mg/L），GOS1敲除通过抑制逆行运输增强分泌，而VPS5敲除则导致OVA完全滞留胞内。该研究为理性改造酵母宿主提高功能性食品蛋白产量提供了新策略。

　　

随着全球对可持续食品、粮食安全和动物福利问题的日益关注，寻找替代蛋白质来源已成为食品科学领域的重要研究方向。其中，利用微生物宿主重组生产动物源蛋白技术因其绿色、高效的特点而备受瞩目。卵清蛋白（Ovalbumin, OVA）作为蛋清中的主要蛋白质组分，占比高达54%，因其优异的乳化、发泡和凝胶特性被广泛应用于食品工业。此外，OVA还被证实是多种生物活性肽的前体物质，具有抗氧化、抗菌和免疫调节潜力，在营养保健品和制药领域展现出广阔前景。

尽管合成生物学和代谢工程的最新进展使复杂真核蛋白在微生物平台中的表达成为可能，其中酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因其公认安全（GRAS） status、遗传背景清晰以及具备真核蛋白折叠和分泌系统等优势成为首选宿主之一，但异源蛋白（如OVA）的高效分泌仍面临重大挑战。折叠效率低、囊泡运输限制以及分泌途径中的蛋白降解等问题严重制约了其产业化应用。

针对这些瓶颈问题，研究人员已经探索了多种策略，包括密码子优化、信号肽工程和分子伴侣共表达等。然而，酿酒酵母中OVA的产量和分泌水平仍远未达到商业化应用要求。因此，需要更全面、系统水平的工程化策略来同时克服多重限制因素。

在此背景下，韩国中央大学食品科学与生物技术学院的研究团队在《FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY》上发表了最新研究成果。该研究旨在通过系统修饰与蛋白质生产和运输相关的关键遗传元件，增强酿酒酵母中重组OVA的分泌效率。研究团队特别选取了14个与转录调控、膜脂生物合成、内质网质量控、囊泡运输和细胞壁重塑相关的基因进行敲除或过表达操作，这种多靶点工程方法为优化酵母作为细胞工厂无动物源生产功能性食品蛋白（如OVA）提供了新见解。

关键技术方法方面，研究以前期构建的+P1/K2菌株（整合PpGK-EPX1sp-ovalbumin表达盒并共表达PDI1和KAR2分子伴侣）为背景，采用CRISPR/Cas9基因组编辑系统对目标基因进行精确敲除，并通过酵母整合质粒（YIPs）在CS6位点实现特定基因（INO2、COG5、ERV29）的过表达。发酵实验在YP50D培养基中进行，通过免疫印迹和密度定量分析检测OVA胞内积累与胞外分泌水平。

优化培养条件促进OVA高效分泌

研究人员首先通过优化前培养培养基和发酵温度为OVA分泌建立基线。结果显示，与最小培养基YSC相比，使用丰富培养基YP20D进行前培养可使最大细胞干重（DCW）增加32%，胞外OVA浓度提高63%。尽管此前研究表明低于最适生长温度（30°C）的培养条件可增强异源蛋白生产，但本研究中20°C、25°C和30°C的温度对比实验表明，降低培养温度并未进一步提高OVA分泌效率，推测是由于在已优化的+P1/K2菌株条件下，较低温度下的表达速率降低并未能继续改善蛋白质折叠效率。

遗传因子功能评估与分泌机制解析

在测试的14种遗传修饰中，GOS1或PAH1的敲除均显著提高了OVA分泌水平。其中PAH1敲除效果最为突出，使特异性OVA分泌量达到0.369±0.007 mg/g细胞，胞外OVA浓度为5.683±0.496 mg/L，较+P1/K2背景菌株分别提升67%和74%。相反，VPS5敲除导致OVA在胞内积累且胞外完全检测不到分泌产物，表明其存在分泌缺陷而非表达问题。

PAH1编码一种负调控磷脂生物合成的磷脂酸磷酸酶，其敲除已知会引起内质网膜增殖，从而增加折叠能力和运输表面积。虽然INO2过表达和OPI1敲除也靶向相同的磷脂生物合成途径，但这些修饰在+P1/K2背景中并未增强OVA分泌。这种差异可能源于调控程度或实现的内质网膜扩张程度不同：PAH1敲除直接破坏脂质去磷酸化和膜重塑，而INO2过表达和OPI1缺失的转录调控可能不足以克服已优化菌株中存在的代谢和结构瓶颈。

值得注意的是，GOS1和VPS5均参与逆行运输但对OVA分泌产生相反影响。GOS1编码一种高尔基体定位的SNARE蛋白，参与高尔基体到内质网的逆行运输。GOS1敲除后OVA分泌增加表明，OVA在内质网中的滞留或积累对其分泌效率产生负面影响。这一发现与前期研究一致，即内质网驻留分子伴侣（如PDI1和KAR2）的共表达可缓解内质网应激并增强OVA分泌。这些结果共同暗示内质网可能是OVA分泌的瓶颈，减少分泌货物从高尔基体到内质网的逆行运输有助于防止其在内质网中的不良积累。

相比之下，VPS5编码负责从内体到高尔基体回收的回收复合体核心组分。VPS5敲除可能损害分泌货物或运输 machinery 从内体返回高尔基体的逆行运输，导致OVA错误分选至内体区室。由于高尔基体对OVA的处理能力似乎充足，将OVA从该区室转移出去会破坏分泌途径，最终导致OVA在胞内积累而胞外检测不到。

拷贝数增加与分泌瓶颈的再验证

研究还探讨了增加基因拷贝数对OVA分泌的影响，发现在+P1/K2菌株基因组中整合额外OVA表达盒并未显著改变分泌水平。这一结果说明在仅携带一个表达盒的+P1/K2菌株中，OVA分泌不受表达水平限制，而是受未解决的内质网应激这一持续瓶颈因素制约。因此，GOS1或PAH1敲除带来的OVA分泌改善很可能源于它们直接或间接缓解内质网应激的作用。

研究结论与讨论部分强调，通过靶向遗传工程缓解内质网应激是增强酵母重组蛋白分泌的有效策略。PAH1敲除通过促进磷脂生物合成和膜扩张显著提升分泌效率，GOS1敲除则通过平衡囊泡运输方向优化蛋白转运。相反，VPS5敲除导致的逆行运输中断证实了内体-高尔基体循环对分泌过程的重要性。这些发现不仅为理解酵母分泌途径调控机制提供了新见解，也为理性设计高效微生物细胞工厂生产无动物源功能蛋白奠定了理论基础。该研究展示的多靶点工程策略可扩展至其他高价值重组蛋白的生产，推动食品生物技术领域的可持续发展。