基于卷积神经网络的自动化全脑组织病理分析在突触核蛋白病小鼠模型中的开发与应用

《npj Parkinson's Disease》：Development of convolutional neural networks for automated brain-wide histopathological analysis in mouse models of synucleinopathies

　　本研究针对传统组织病理分析耗时耗力、存在主观偏差的问题，开发了一种基于卷积神经网络(CNN)的高通量自动化分析流程。研究人员训练了五种特异性CNN模型，用于自动识别小鼠脑区并检测神经退行性变、神经炎症及α-突触核蛋白(aSyn)聚集等关键病理标记。该技术将分析时间从数周缩短至分钟级，在帕金森病(PD)和多系统萎缩(MSA)等多种小鼠模型中实现了全脑范围、细胞分辨率的高精度定量分析，显著提升了临床前研究的可重复性和预测价值。

　　

在神经退行性疾病研究领域，突触核蛋白病（包括帕金森病和多系统萎缩）的病理机制探索和治疗方法开发严重依赖临床前动物模型。传统组织病理学分析作为评估疾病进展和治疗反应的关键手段，需要研究人员通过显微镜手动计数和标注神经元死亡、神经炎症和α-突触核蛋白聚集等病理变化。这个过程不仅劳动强度大、耗时漫长，还容易引入操作者间变异，成为制约研究效率和可重复性的瓶颈。随着人工智能技术的快速发展，卷积神经网络（CNN）为组织病理学分析带来了革命性的机遇，但现有模型大多仍需手动标注感兴趣区域，限制了其高通量应用的潜力。

发表于《npj Parkinson's Disease》的最新研究针对这一挑战，开发了一套基于CNN的自动化分析流程，实现了对小鼠脑组织切片的高通量、无偏倚分析。该研究通过训练五种特异性CNN模型，成功实现了脑组织自动检测、多脑区自主识别以及关键病理标记的精准定量，将传统需要数周的分析工作缩短至几分钟内完成，为神经退行性疾病研究提供了强大工具。

研究采用的主要技术方法包括：基于Aiforia? Create平台（AI引擎版本7）训练监督式CNN模型，使用全脑切片图像数据；建立分层架构模型（包含区域层和对象层），采用实例分割技术获取细胞形态学指标；通过立体计量学和ImageJ光学密度分析进行模型验证；利用定制Python代码进行数据后处理，实现脑区合并和半球特异性分析。实验使用8周龄雌性C57BL/6J小鼠，通过立体定位注射技术建立PD和MSA模型，包括神经元特异性过表达（rAAV2/7-CMVe-Syn-haSyn）、少突胶质细胞特异性过表达（rAAV2/PHP.eB-MAG-maSyn）及α-突触核蛋白预制纤维（PFF）接种模型。

多巴胺能细胞检测器（DCD）验证结果

研究人员首先验证了DCD模型在检测黑质多巴胺能神经元方面的性能。通过比较CNN分析与立体计量学结果，发现两种方法在TH⁺细胞计数上无显著差异，且均能有效检测aSyn过表达引起的神经退行性变。在对照组中，DCD计数为4,248±598个TH⁺细胞，立体计量学为4,961±831个；在aSyn过表达组中，DCD检测到2,026±786个TH⁺细胞，立体计量学为2,541±1,083个。两种方法高度相关（Pearson r=0.96），且DCD结果变异性更小，表明其通过全切片分析避免了立体计量学的抽样误差。

+细胞"（第3层，白色）。b 对照组和aSyn过表达小鼠黑质中TH和甲苯紫染色代表性图像及DCD模型检测的TH⁺细胞密度热图。c DCD与立体计量学测量的同侧黑质TH⁺细胞数量比较'>

多巴胺能轴突检测器（DAD）性能评估

针对多巴胺能轴突密度定量，研究团队开发了DAD模型，通过测量背侧纹状体TH⁺染色强度评估轴突变性。与ImageJ手动光学密度分析相比，DAD在检测aSyn小鼠同侧背侧纹状体TH⁺轴突密度损失方面表现相当（DAD：53.6±10.7%损失；ImageJ：54.4±13.1%损失），且两者结果显著相关（Spearman r=0.86）。这表明DAD能够可靠检测早期神经退行性变化，为多巴胺系统完整性评估提供了有效工具。

+轴突密度。对照小鼠注射PBS，aSyn小鼠在黑质注射表达aSyn的rAAV载体。注射后6个月进行分析。a 未标注TH免疫组化示例及DAD各层检测结果："组织"（第1层，灰色）和"脑区"（第2层，粉色）。b 对照组和aSyn小鼠纹状体切片TH染色代表性图像。c DAD与ImageJ手动光学密度分析比较背侧纹状体TH⁺轴突密度损失'>

神经元细胞检测器（NCD）的全脑分析能力

NCD模型能够自主识别28个不同脑区并定量神经元数量。在少突胶质细胞aSyn过表达的MSA模型中，NCD检测到背侧纹状体神经元损失（12.3±5.1%），与立体计量学结果（15.5±9.8%）相当。全脑分析进一步揭示aSyn过表达小鼠在苍白球（30.4±9.7%）和背侧纹状体（9.1±2.3%）等多个脑区存在显著神经元损失，展示了模型在检测广泛神经退行性变方面的优势。

+细胞区域"（第3层，淡红色）和"NeuN⁺细胞"（第4层，黄色）。b NCD与立体计量学测量的同侧背侧纹状体NeuN⁺细胞数量比较'>

小胶质细胞检测器（MCD）的双重评估功能

MCD模型不仅定量小胶质细胞密度，还能通过形态学参数（如圆形度）评估其反应状态。在少突胶质细胞aSyn过表达模型中，MCD检测到多个脑区小胶质细胞密度增加10-20%，同时反应性显著增强。值得注意的是，密度和反应性变化模式不完全重叠，提示可能存在脑区特异性小胶质细胞表型，展示了模型在解析神经炎症复杂性方面的价值。

+细胞"（第3层，红色）。b 全脑MCD分析小胶质细胞密度，按相对于对照组平均值的百分比变化排序'>

pSer129-aSyn检测器（pSynD）的病理分类能力

pSynD模型创新性地将pSer129-aSyn⁺病理分为神经突包涵体（丝状结构）和细胞包涵体（球状或三角形结构）。在PFF接种模型中，pSynD不仅精确绘制了病理在全脑的分布，还发现神经突和细胞包涵体的区域分布模式存在差异，为研究aSyn聚集动态和传播机制提供了新视角。

+神经突和细胞病理。对照小鼠注射PBS，aSyn小鼠在背侧纹状体注射PFF。注射后8个月进行分析。a 未标注pSer129-aSyn免疫组化示例及pSynD各层检测结果："组织"（第1层，灰色）、"脑区"（第2层，不同颜色）、"pSer129-aSyn⁺区域"（第3层，神经突包涵体为蓝色，细胞包涵体为洋红色）和"细胞包涵体"（第4层，粉色）。b 代表性PFF注射小鼠pSer129-aSyn⁺神经突包涵体（左，蓝色）和细胞包涵体（右，洋红色）分布'>

模型验证显示，所有CNN模型的F1分数与三位验证者间的相互评估结果无显著差异，平均F1分数超过80%，达到专家水平精度。唯一例外的是pSynD模型的"pSer129-aSyn区域"层（F1分数75%），但这仍在验证者间变异范围内（F1分数74%），反映了该标记物本身的注释复杂性。

该研究的核心创新在于建立了完整的自动化分析流程，将组织病理分析时间从数周缩短至几个小时（16只动物全面分析仅需4-6小时），且分析规模增加时所需时间不会线性增长。与传统方法相比，CNN模型通过全区域检测消除了抽样误差，提供连续定量读数而非半定量评分，显著增强了统计效能和结果可重复性。

尽管该技术需要专门的软件平台（Aiforia?），但研究团队已公开所有Python后处理代码（GitHub），方便其他研究者应用。研究人员强调，在使用这些模型时仍需进行组织切片完整性检查和染色优化，并对分析结果进行视觉监督，确保识别准确性。随着免疫组化染色方案的演进，模型可通过增量训练适应新条件，增强不同研究机构间的普适性。

这项研究开发的CNN模型不仅为突触核蛋白病研究提供了强大工具，其方法论也可应用于其他神经炎症或神经退行性疾病的临床前研究。通过实现脑范围、细胞分辨率的高通量分析，该技术有望显著提升临床前研究的预测价值，加速神经退行性疾病治疗方法的开发进程。