ATP13A2基因敲除大鼠模型揭示帕金森病自噬-溶酶体通路障碍与神经发育缺陷

《npj Parkinson's Disease》：Phenotypic characterization of an Atp13a2 knockout rat model of Parkinson’s disease

　　本文推荐研究聚焦于Kufor-Rakeb综合征（KRS）这一青少年型帕金森病（PD）的疾病建模难题。研究者通过CRISPR/Cas9技术构建了首个Atp13a2基因敲除（KO）大鼠模型，系统揭示了ATP13A2缺失导致的自噬流阻滞、溶酶体pH失衡、锌稳态失调等关键病理特征，同时发现该模型虽未出现明显黑质纹状体多巴胺能神经退行性变，但表现出年龄依赖性的精细运动缺陷和神经元电活动异常。该模型为研究自噬-溶酶体通路（ALP）在PD发病机制中的作用提供了重要平台。

　　

帕金森病（Parkinson's disease, PD）作为第二大常见的神经退行性疾病，其主要病理特征包括黑质致密部多巴胺能神经元的进行性丢失以及α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）聚集形成的路易体（Lewy bodies）。尽管大多数PD病例为散发性，但约有10%与遗传基因突变相关。其中，ATP13A2基因（编码一种溶酶体P5B型ATP酶蛋白）的突变被确定为Kufor-Rakeb综合征（Kufor-Rakeb syndrome, KRS）的病因，这是一种常染色体隐性遗传的青少年型帕金森综合征。KRS患者通常在青少年时期出现帕金森症状、锥体束征、核上性凝视麻痹和痴呆等复杂临床表现。ATP13A2蛋白定位于溶酶体膜，被认为参与维持溶酶体腔内pH稳态、重金属离子（如Zn²⁺、Mn²⁺）的转运以及自噬-溶酶体通路（autophagy-lysosomal pathway, ALP）的正常功能。其功能缺失会导致溶酶体碱化、酶活性降低以及α-syn的异常聚集。然而，由于KRS极为罕见，开发能够准确模拟该疾病关键病理特征且具有预测价值的动物模型对于理解发病机制和验证治疗策略至关重要。

目前，虽然已有Atp13a2基因敲除（knockout, KO）小鼠模型，但其表型相对温和，且不出现显著的黑质纹状体多巴胺能神经元丢失，这提示可能存在发育代偿机制。与非人灵长类模型相比，大鼠模型在行为学评估（尤其是精细运动技能）方面具有独特优势，且更适合进行复杂的神经科学操作。因此，构建并系统表征一种Atp13a2 KO大鼠模型，将有助于更深入地揭示ATP13A2在神经发育和PD病理进程中的具体作用。

本研究由法国波尔多大学、普瓦捷大学等多个研究团队合作完成，发表在《npj Parkinson's Disease》杂志上。研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功构建了首个Atp13a2全基因敲除大鼠模型，并对其从出生后到成年期的神经发育、运动行为、神经病理、神经化学、神经炎症、自噬功能、重金属稳态以及电生理特性进行了长达16个月的全面纵向表征。

为了开展这项研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Atp13a2敲除大鼠模型；通过一系列行为学测试（包括神经发育里程碑评估、步进测试、旷场活动度测定、单颗粒取食任务等）系统分析运动功能；采用高效液相色谱法（HPLC）检测多个脑区神经递质水平；利用免疫组织化学和体视学计数评估黑质纹状体通路完整性及α-syn病理；通过电子显微镜观察自噬相关细胞器的超微结构；采用腺相关病毒（AAV）介导的mCherry-GFP-LC3报告系统在体评估自噬流；利用同步辐射X射线荧光（SR-XRF）显微技术定量分析黑质区重金属元素含量；并运用在体电生理记录技术分析黑质多巴胺能神经元的放电活动。

神经发育影响

研究人员首先评估了Atp13a2 KO对大鼠早期神经发育的影响。结果发现，KO雌性大鼠从出生后第20天（P20）开始体重显著低于野生型（WT）雌鼠。更为显著的是，KO大鼠（无论雌雄）睁眼这一重要发育里程碑比WT对照组延迟了1天。此外，KO雌性大鼠的听觉惊吓反应延迟了两天。在运动发育方面，翻正反射、负向地性、悬崖回避和自发运动等测试均显示，KO幼鼠在特定时间段（如P9-P12）存在轻微的但具有统计学意义的运动发育迟缓，表明ATP13A2缺失会导致有限的但显著的神经发育延迟，这与KRS的青少年发病特点相呼应。

成年ATP13A2 KO大鼠的运动行为受损

对3至12月龄成年大鼠的行为学分析显示，KO雌性大鼠的较低平均体重持续至9月龄和12月龄。在运动方面，12月龄KO大鼠在步进测试中表现出更多的后退调整步数。在旷场实验中，KO大鼠表现出活动过度，总光束中断次数显著高于WT大鼠，这一表型与近期报道的一名KRS患者症状相似。尤为重要的是，在评估精细运动技能的单颗粒取食任务中，12月龄的KO大鼠从实验第2天起获取的糖丸数量就显著少于WT大鼠，表明其出现了与帕金森病相关的精细运动技能缺陷。

病理学与神经化学表型分析

尽管行为学存在差异，但令人惊讶的是，即使在16月龄的高龄KO大鼠中，酪氨酸羟化酶（TH）染色和体视学计数均未发现黑质多巴胺能神经元数量或纹状体多巴胺能神经末梢密度的显著丢失。然而，高效液相色谱（HPLC）分析揭示了KO大鼠存在年龄和脑区特异性的神经递质水平改变。例如，在3月龄时，KO大鼠纹状体内的谷氨酸、多巴胺及其代谢产物3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）水平显著升高；而在12月龄时，海马体内的γ-氨基丁酸（GABA）和谷氨酸水平则显著降低。这些变化可能反映了神经环路的功能代偿或适应。对内源性α-syn的分析显示，KO大鼠黑质内的总α-syn和磷酸化α-syn（pS129-α-syn）水平与WT无差异，但纹状体内的总α-syn染色显著增加，提示突触α-syn在该脑区积累。

ATP13A2功能缺失诱导的神经炎症

神经炎症是PD的另一个重要特征。研究发现，在16月龄KO大鼠中，小胶质细胞（Iba1染色）在纹状体、黑质和皮层与WT无差异，但在海马区显著增加（尤其在雌性中）。相反，星形胶质细胞（GFAP染色）的反应更为强烈，在纹状体、黑质和运动皮层中，KO大鼠的染色强度均显著高于WT大鼠，并且这种反应存在性别和脑区特异性（如在纹状体和皮层，雄性反应更强；而在黑质，雌性反应更强）。这些数据表明，ATP13A2缺失以性别和区域特异性的方式诱导了神经炎症。

ATP13A2 KO大鼠黑质自噬过程缺陷

ATP13A2是溶酶体多胺转运ATP酶，参与调节溶酶体腔内pH值。通过电子显微镜观察黑质多巴胺能神经元内的自噬相关细胞器发现，6月龄和12月龄KO大鼠的自噬体数量显著减少，而早期和晚期自噬溶酶体的数量却显著增加。同时，在12月龄时，多泡体（multivesicular bodies）的数量也显著增加。这些结果表明，自噬体形成后与溶酶体的融合或内容物降解过程受阻，导致未降解的自噬溶酶体积累。体外Cathepsin D（CatD）活性测定也证实，KO大鼠中脑溶酶体富集组分的蛋白酶活性显著降低。进一步通过AAV介导的mCherry-GFP-LC3报告系统进行在体自噬流分析显示，KO大鼠黑质内mCherry斑点（代表自噬溶酶体）与黄色斑点（代表未与溶酶体融合的自噬体）的比率显著升高，再次证实自噬流在降解步骤存在阻滞。

此外，作为KRS和相关模型的病理标志，脂褐质（lipofuscin）在KO大鼠黑质神经元中的数量和所占面积均显著增加。免疫荧光染色还发现，KO大鼠黑质多巴胺能神经元溶酶体（LAMP2阳性）内与多胺（亚精胺spermidine和精胺spermine）共定位的囊泡增多，表明ATP13A2缺陷导致多胺在溶酶体腔内滞留。通过同步辐射X射线荧光（SR-XRF）分析黑质区重金属含量，发现KO大鼠锌（Zn）浓度显著降低，而锰（Mn）、钙（Ca）、铁（Fe）、铜（Cu）和硫（S）浓度无变化，这与既往报道的ATP13A2相关模型中的表型一致。

电生理学分析

尽管未观察到明显的神经退行性变，但在黑质多巴胺能神经元的在体电生理记录中发现了神经元功能异常的迹象。在3月龄和6月龄时，KO大鼠多巴胺能神经元的放电频率和爆发系数（bursting coefficient）均显著高于WT大鼠，表现为更多的高频高爆发（HFHB）神经元。然而，到12月龄时，这种异常的电活动基本恢复正常，与WT大鼠无显著差异。这表明ATP13A2缺失在早期引起了多巴胺能神经元的过度兴奋，但随着年龄增长出现了代偿或适应。

Atp13a2 KO并未加剧AAV-A53T α-syn或AAV-hTyrosinase诱导的病理

为了探究ATP13A2缺失是否会增加多巴胺能神经元对其它致病因素（如α-syn过表达或神经黑色素积累）的易感性，研究人员向3月龄WT和KO大鼠的黑质分别注射了携带人A53T突变型α-syn（AAV-A53T-SYN）或人酪氨酸酶（AAV-hTyr）的腺相关病毒。五个月后，AAV-A53T-SYN注射均导致了WT和KO大鼠黑质多巴胺能神经元的显著丢失（约50-64%），但KO并未显著加剧这种神经退行性变。尽管在KO+SYN组大鼠的黑质检测到更高水平的人α-syn蛋白，并且其纹状体pS129-α-syn水平更高，但蛋白酶K（PK）消化实验反而显示KO+SYN组中的pSyn对PK更敏感（即更少形成不可溶的聚集物）。同样，在AAV-hTyr诱导的神经黑色素模型中，KO也未能显著加剧酪氨酸酶表达引起的多巴胺能神经元丢失，但确实增加了pS129-α-syn在黑质的积累。

本研究首次全面表征了CRISPR/Cas9生成的Atp13a2 KO大鼠模型。该模型成功再现了KRS和PD的多种关键特征，包括神经发育延迟、年龄依赖性运动功能障碍（特别是精细运动缺陷和活动过度）、自噬-溶酶体通路功能严重受损（表现为自噬流阻滞、溶酶体腔内多胺滞留、CatD活性降低和脂褐质积累）、锌稳态失调、区域特异性神经炎症以及早期多巴胺能神经元电活动异常。然而，与某些条件性敲除模型或病毒介导的成年期基因敲降模型不同，这种全身性基因敲除并未导致自发的、显著的黑质纹状体多巴胺能神经退行性变，这强烈提示在胚胎期及发育早期可能存在有效的代偿机制，从而在成年期保护了多巴胺能神经元的存活。这种代偿机制可能涉及其他P5B型ATP酶（如Atp13a3）的上调，或自噬等相关通路在生命早期的适应性重塑。

该研究的结论强调了ATP13A2在神经发育和维持神经元稳态中的重要作用，其功能缺失主要通过破坏自噬-溶酶体通路导致神经元功能障碍，而非直接引发快速神经元死亡。此Atp13a2 KO大鼠模型为深入研究自噬-溶酶体通路在帕金森病及其他相关神经退行性疾病发病机制中的作用提供了一个独特而有价值的平台，特别是为探索针对溶酶体功能的治疗策略开辟了新的验证途径。未来的研究可着眼于构建条件性、成年期诱导的Atp13a2敲除大鼠模型，以规避发育代偿，从而更准确地模拟KRS患者的神经退行性病理过程。