清醒小鼠脑膜移植胰岛细胞的稳定颅内成像平台开发及其在生理条件下β细胞钙动力学研究中的应用

《Nature Communications》：Stable intracranial imaging of dura mater-engrafted pancreatic islet cells in awake mice

　　本研究针对传统活体显微镜技术中麻醉干扰生理状态、难以对深部组织进行长期稳定观测的难题，开发了一种将胰岛细胞移植于小鼠脑膜并结合Mobile HomeCage系统的清醒动物颅内成像平台。研究人员通过该平台实现了对移植胰岛血管神经整合过程的长期监测，首次在清醒状态下记录了葡萄糖刺激下胰岛β细胞Ca2+振荡的动态变化，发现异氟烷麻醉会显著改变β细胞[Ca2+]i动力学特征。该研究为研究内分泌微器官功能提供了革命性的技术手段，对糖尿病病理机制研究具有重要价值。

　　

在生物医学研究领域，活体显微镜技术一直是观察生命活动最直观的手段，但这项技术却面临着难以逾越的障碍：如何在不干扰生理状态的前提下，对深部组织进行长期稳定的观测？传统方法通常需要对实验动物实施麻醉，而这会显著改变生理状态；此外，许多重要器官由于位置深在，缺乏合适的光学通路，使得研究人员难以一窥其真容。

胰腺胰岛作为调控血糖的关键微器官，其功能异常与糖尿病发生发展密切相关。理解胰岛β细胞在生理条件下的工作原理，特别是其钙离子（Ca²⁺）信号动态，对揭示糖尿病发病机制至关重要。然而，由于胰岛深埋于胰腺组织中，传统方法难以实现长期稳定的在体观测。更棘手的是，常用麻醉剂如异氟烷会干扰β细胞的电生理特性和Ca²⁺信号传导，导致观察结果与真实生理状态存在偏差。

面对这些挑战，来自瑞典卡罗林斯卡学院等机构的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项创新性研究。他们独辟蹊径地将胰岛细胞移植到小鼠脑膜（dura mater）上，结合先进的Mobile HomeCage技术，建立了一个能够在清醒动物身上进行长期稳定观测的活体成像平台。这一策略巧妙利用了脑膜易于光学观测的特点，同时避免了麻醉对生理状态的干扰。

研究人员采用的技术方法包括：通过颅窗手术将表达GCaMP3钙指示剂的胰岛移植至脑膜；利用Mobile HomeCage系统实现清醒小鼠头部固定下的共聚焦显微镜成像；通过静脉注射荧光染料评估血管通透性和血流量；使用免疫组化分析神经支配模式；通过葡萄糖耐量试验和C肽检测评估移植胰岛功能；采用红细胞标记技术定量血流速度；并对β细胞[Ca²⁺]_i动力学进行振荡周期、振幅、平台期比例等多参数分析。

脑膜移植胰岛的血管化和神经支配

研究显示，移植到脑膜上的胰岛能够成功与宿主血管系统整合。移植后3周，通过静脉注射TMR-葡聚糖（2000 kDa）可见新生血管已深入移植胰岛内部。定量分析表明，血管化过程从第1周开始，到第4周基本完成，血管体积占β细胞体积的比例达到约30%。这些新生血管的直径多超过6微米，与天然胰岛血管特征相似。

除了血管整合，移植胰岛还建立了神经连接。移植后12周的免疫组化分析显示，胰岛内部出现了囊泡乙酰胆碱转运体（VAChT）阳性的副交感神经纤维，而酪氨酸羟化酶（TH）阳性的交感神经支配相对较少。这表明移植胰岛不仅获得了血液供应，还建立了与神经系统的连接，为功能整合奠定了基础。

血管完整性和血流动力学特征

研究人员进一步比较了移植胰岛内部血管与周围脑膜血管的通透性差异。通过同时注射高低分子量葡聚糖发现，胰岛内血管对10 kDa葡聚糖的外渗速度显著低于周围脑膜血管，表明移植胰岛形成了更具选择性的血管屏障。

更有趣的是，研究人员比较了清醒和麻醉状态下的胰岛血流速度。结果显示，异氟烷麻醉使红细胞流速增加了约74%，而血管直径未见明显变化。这一发现提示，麻醉状态会显著改变移植胰岛的血液灌注情况，可能影响其生理功能。

麻醉与清醒状态下β细胞[Ca²⁺]_i动力学差异

研究团队利用GCaMP3钙指示剂，在单细胞水平记录了β细胞的[Ca²⁺]_i动态变化。通过监测同一动物从清醒到麻醉再到恢复的全过程，他们发现异氟烷麻醉会显著降低[Ca²⁺]_i振荡的振幅，延长振荡周期，并减少平台期比例。而另一种麻醉剂Hypnorm对[Ca²⁺]_i动态的影响相对较小。

配对相关性分析显示，异氟烷麻醉还会破坏β细胞网络的同步性活动。这些发现从细胞水平解释了为何异氟烷麻醉会抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌，导致血糖调节异常。

人胰岛移植物的功能验证

为验证该平台的临床应用价值，研究人员还将人胰岛移植到免疫缺陷小鼠的脑膜上。结果显示，移植后的人胰岛能够分泌C肽（胰岛素分泌的标志物），且在葡萄糖刺激下呈现适当的动态变化。这表明脑膜移植的人胰岛成功实现了与宿主代谢系统的功能整合。

葡萄糖刺激下β细胞[Ca²⁺]_i动态响应

在清醒小鼠中，皮下注射葡萄糖可诱发典型的β细胞[Ca²⁺]_i响应：随着血糖升高，[Ca²⁺]_i振荡振幅逐渐降低，周期缩短，而平台期比例增加。这些变化反映了β细胞对持续代谢需求的适应性调整。重要的是，β细胞间的同步性在整个过程中保持稳定，支持了"节拍器假说"，即胰岛网络通过维持稳定的时间节律来协调脉冲式胰岛素分泌。

研究结论强调，脑膜作为一个易于观测的移植位点，能够支持胰岛长期存活和功能整合。结合Mobile HomeCage的清醒动物成像平台，为研究微器官生理功能提供了前所未有的技术手段。该研究不仅揭示了麻醉对胰岛功能的显著影响，也展示了在生理条件下研究细胞动态的可行性，对糖尿病等代谢性疾病的研究具有重要启示。

这项研究的创新之处在于它将组织工程、活体成像和生理学研究巧妙结合，突破了传统技术的局限。通过提供一個在生理条件下观察细胞活动的时间窗口，该平台有望在未来应用于更多生物医学研究领域，推动我们对生命过程的理解。