两种数字PCR平台在转基因大豆事件定量检测中的比较

《GM Crops & Food》：Comparison of two digital PCR platforms for quantification of genetically modified soybean events

　　转基因大豆检测方法在两种数字PCR平台上的验证研究，比较了Bio-Rad QX200和Qiagen QIAcuity平台在定量MON-04032–6和MON89788事件中的性能，证实其符合ISO/IEC 17025标准及欧盟法规要求，动态范围达0.05%-100%且R2>0.98，验证了多平台转化的可行性。

　　基因工程技术在现代农业和食品工业中扮演着重要角色，尤其在转基因作物（GMO）的检测与定量分析方面。随着全球转基因作物种植面积的不断扩大，对GMO检测技术的要求也日益提高。在欧洲，根据相关法规，任何含有超过0.9%转基因成分的食品或饲料都必须进行标识，因此，检测和定量转基因成分的准确性成为确保食品安全和监管合规的关键环节。近年来，数字聚合酶链反应（dPCR）技术因其在定量分析中的优势，逐渐被用于替代传统的实时定量PCR（qPCR）方法，特别是在需要高精度和减少外部校准依赖的场景中。

dPCR技术通过将DNA样本分割成数万个独立的反应单元（称为分区），然后对每个分区进行终点荧光检测，从而实现对目标DNA的绝对定量。这种方法相比qPCR具有更高的准确性和抗PCR抑制剂干扰的能力，同时也更适合进行多重检测。本研究的目的是对两种不同的dPCR平台——Bio-Rad QX200和Qiagen QIAcuity——进行内部验证，评估它们在检测两种常见转基因大豆事件（MON-04032–6和MON89788）方面的性能。研究结果表明，这两种平台在关键的检测参数上均符合国际标准和欧洲监管机构的验收要求，且其检测性能与qPCR方法相当，适用于进行完整的验证试验。

### 转基因作物的背景与检测需求

自1996年转基因作物首次被引入市场以来，其种植面积持续增长。截至2023年，全球转基因作物的种植面积已达到2.063亿公顷，其中大豆是最广泛种植的转基因作物之一，占据了约1.009亿公顷的面积。在欧洲，转基因成分的监管较为严格，任何含有超过0.9%授权转基因成分的食品或饲料都必须进行标识。这一规定对检测方法的准确性和可靠性提出了更高的要求，以确保检测结果能够真实反映转基因成分的含量。

为了满足这一监管需求，转基因作物的检测方法必须经过严格的验证程序。根据欧洲参考实验室（EURL-GMFF）的规定，转基因作物的开发者需要提供一种定量特定转基因事件的方法，并资助一项协作试验以验证该方法的有效性。目前，所有提交至EURL-GMFF的转基因检测方法均基于qPCR技术进行开发和优化。然而，随着转基因作物种类的增加，qPCR方法在检测精度和成本效益方面逐渐暴露出局限性。例如，qPCR依赖于标准曲线进行定量，这可能受到PCR抑制剂的影响，导致结果偏差。此外，随着检测样本的复杂性增加，标准曲线的构建和维护变得更加繁琐。

### dPCR技术的优势与应用

dPCR技术的出现为解决上述问题提供了新的思路。该技术通过将DNA样本分割成数万个独立的分区，每个分区都独立进行PCR扩增和终点荧光检测，从而实现对目标DNA的绝对定量。与qPCR相比，dPCR具有以下优势：

1. **无需外部校准**：由于dPCR通过统计方法（如泊松分布）计算目标DNA的绝对浓度，因此不需要依赖标准曲线进行校准，提高了检测的便捷性和准确性。
2. **抗PCR抑制剂干扰**：dPCR在分区后的检测过程中，能够有效减少PCR抑制剂对扩增效率的影响，从而提高检测结果的稳定性。
3. **适合多重检测**：dPCR能够同时检测多个目标，即所谓的“多重PCR”，这在转基因作物检测中尤为重要，因为许多转基因作物可能含有多个转基因事件。

此外，dPCR还具备更高的灵敏度和动态范围，能够更精确地检测低浓度的转基因成分。这些特性使得dPCR成为一种理想的转基因检测工具，尤其是在需要高精度和高可靠性的监管场景中。

### dPCR平台的比较与验证

本研究采用了两种不同的dPCR平台进行转基因大豆的检测与定量分析：Bio-Rad QX200 ddPCR系统和Qiagen QIAcuity dPCR系统。两种平台的检测原理有所不同，Bio-Rad系统基于水-油乳液技术，将DNA样本分割成数万个微小的液滴，每个液滴代表一个独立的PCR反应。而Qiagen系统则采用纳米板（nanoplate）技术，通过微流控芯片实现DNA的分区和PCR扩增。两种平台的检测流程均包括分区、PCR扩增、终点荧光检测和数据分析，但具体的分区方式和检测流程存在差异。

为了确保两种平台的检测方法具有可比性，本研究在实验设计和数据处理方面进行了统一。例如，使用相同的引物和探针组合，确保检测目标的一致性。同时，实验条件（如PCR循环参数、温度梯度、反应体积等）也进行了优化，以满足两种平台的检测需求。通过这一过程，研究者能够评估两种平台在转基因大豆检测中的性能差异，并验证其是否符合欧洲监管机构的验收标准。

### 检测性能的评估

在本研究中，转基因大豆检测方法的性能评估包括多个关键参数：

1. **特异性**：特异性是指检测方法能够准确识别目标转基因成分，而不与其他非目标序列产生交叉反应。通过计算机模拟和实验验证，研究者评估了两种平台在检测MON-04032–6和MON89788转基因大豆时的特异性。结果表明，两种平台均未检测到非目标序列的交叉反应，且引物和探针的二级结构（如发夹结构、引物二聚体）对检测结果没有显著影响。
2. **交叉干扰（Cross-talk）**：交叉干扰是指在多重检测过程中，不同引物或探针之间的信号重叠。在本研究中，通过在无转基因成分的样本中检测是否存在交叉信号，验证了两种平台的交叉干扰情况。结果表明，两种平台均未观察到明显的交叉信号，说明其在多重检测中的性能良好。
3. **稳健性（Robustness）**：稳健性是指检测方法在不同实验条件下仍能保持一致的性能。本研究通过改变反应条件（如引物浓度、温度梯度、反应体积等），评估了两种平台在这些变化下的检测稳定性。结果显示，两种平台在轻微的实验条件变化下仍能保持较高的检测一致性，说明其方法具有良好的稳健性。
4. **动态范围（Dynamic Range）**：动态范围是指检测方法能够准确检测的转基因成分浓度范围。本研究评估了两种平台在0.05%至100%转基因含量范围内的检测性能。结果显示，两种平台均能满足动态范围的要求，且检测精度（RSDr）和准确性（Bias）均在可接受范围内。
5. **线性（Linearity）**：线性是指检测方法在不同浓度下的检测结果是否呈线性关系。通过计算R2值和斜率，研究者评估了两种平台在不同转基因含量下的线性关系。结果显示，两种平台均表现出良好的线性关系，且R2值均高于0.98，说明其检测结果具有高度的可预测性和一致性。
6. **不对称定量限（LOQ_asym）**：不对称定量限是指检测方法能够可靠检测的最低转基因含量。本研究通过测试不同浓度的转基因样本，确定了两种平台的LOQ_asym值。结果显示，两种平台的LOQ_asym均符合国际标准和欧洲监管机构的要求，表明其在低浓度转基因检测中具有良好的性能。
7. **测量不确定度（MU）**：测量不确定度是指检测结果的可靠性程度。本研究根据欧洲指南文件，评估了两种平台在转基因检测中的测量不确定度。结果显示，两种平台的测量不确定度均处于可接受范围内，说明其检测结果具有较高的可信度。

### 实验设计与数据处理

在实验设计方面，本研究采用了标准化的流程，以确保两种平台的检测结果具有可比性。首先，使用经过认证的参考物质（CRMs）进行DNA提取和纯度评估。DNA提取过程采用了两种不同的方法：对于Bio-Rad平台，使用RSC PureFood GMO试剂盒进行DNA提取；对于Qiagen平台，采用2% CTAB缓冲液进行DNA提取。随后，将提取的DNA稀释至不同的转基因含量（如0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、10%、100%），并进行dPCR检测。

在数据处理方面，两种平台均使用专用的软件进行数据分析。Bio-Rad QX200平台的数据分析软件（QX Manager 2.1）能够计算每个反应中目标DNA的拷贝数，并基于统计方法（如泊松分布）确定转基因含量。而Qiagen QIAcuity平台的数据分析软件（QIAcuity Software Suite 2.5.0.1）则能够报告目标DNA的浓度，并结合置信区间（95%）评估检测结果的可靠性。此外，两种平台均采用了相同的引物和探针组合，以确保检测目标的一致性。

### 实验结果与分析

通过实验分析，研究者发现两种dPCR平台在转基因大豆检测中均表现出良好的性能。具体而言：

- **特异性**：两种平台均未检测到非目标序列的交叉反应，且引物和探针的二级结构对检测结果没有显著影响。
- **交叉干扰**：在无转基因成分的样本中，两种平台均未观察到明显的交叉信号，说明其在多重检测中的性能良好。
- **稳健性**：两种平台在轻微的实验条件变化下仍能保持较高的检测一致性，表明其方法具有良好的稳健性。
- **动态范围**：两种平台在0.05%至100%转基因含量范围内的检测结果均符合国际标准和欧洲监管机构的要求。
- **线性**：两种平台均表现出良好的线性关系，且R2值均高于0.98，说明其检测结果具有高度的可预测性和一致性。
- **不对称定量限**：两种平台的LOQ_asym值均符合国际标准，表明其在低浓度转基因检测中具有良好的性能。
- **测量不确定度**：两种平台的测量不确定度均处于可接受范围内，说明其检测结果具有较高的可信度。

此外，研究者还评估了两种平台在检测不同转基因大豆事件时的性能差异。结果显示，两种平台在检测MON-04032–6和MON89788转基因大豆时均表现出良好的一致性，且检测结果均符合欧洲监管机构的验收标准。这表明，无论是采用水-油乳液技术的Bio-Rad QX200平台，还是采用微流控纳米板技术的Qiagen QIAcuity平台，均能够满足转基因大豆检测的高精度和高可靠性的需求。

### 实验结论与意义

本研究的结果表明，两种dPCR平台在转基因大豆检测中均表现出良好的性能，且其检测结果符合欧洲监管机构的验收标准。这一发现对于转基因作物的监管具有重要意义，因为它表明dPCR技术可以作为一种可靠的替代方法，用于转基因成分的检测和定量分析。此外，研究结果还表明，dPCR技术在检测精度、抗PCR抑制剂干扰和多重检测方面具有显著优势，能够有效提高转基因检测的效率和准确性。

然而，研究者也指出，两种平台在检测流程和分区方式上存在一定的差异。例如，Bio-Rad QX200平台采用水-油乳液技术，将DNA样本分割成数万个微小的液滴，而Qiagen QIAcuity平台则采用微流控纳米板技术，将DNA样本分割成固定数量的分区。这些差异可能导致检测结果的细微变化，但总体而言，两种平台的检测性能均符合国际标准，且在转基因检测中具有良好的应用前景。

### 未来研究方向

尽管本研究已经验证了两种dPCR平台在转基因大豆检测中的性能，但仍有一些问题需要进一步研究。例如，不同类型的转基因作物可能对dPCR技术的检测性能产生不同的影响，因此需要进一步评估dPCR技术在检测其他转基因作物（如玉米、棉花等）中的适用性。此外，dPCR技术在实际应用中的成本和操作复杂性也需要进一步优化，以提高其在监管实验室中的普及率。

总的来说，本研究为转基因作物的检测提供了新的技术手段，同时也为dPCR技术在食品和饲料检测中的应用提供了重要的参考。随着转基因作物种类的不断增加，dPCR技术有望成为转基因检测的主流方法，为食品安全和监管提供更加可靠和高效的解决方案。