赖氨酸和支链氨基酸能否改善 Lumpfish（一种鱼类）的健康状况并增强其应对压力的能力？

《Aquaculture Reports》：Can lysine and branched-chain amino acids improve lumpfish health and stress resilience?

　　支链氨基酸（BCAAs）和赖氨酸（Lys）的饲料补充可改善慢性压力下 lumpfish 的代谢和免疫应答，降低甘油三酯并提高抗蛋白酶活性。研究显示，限制性饲料组（A）的葡萄糖水平显著升高，而增强剂组（D）的免疫指标更优，表明营养支持能缓解压力对健康的影响。Lumpfish 的福利和抗病能力与饲料中氨基酸水平密切相关，为优化清洁鱼养殖管理提供新策略。

　　近年来，随着人们对动物福利意识的提升， Lumpfish（岩鱼）作为清洁鱼的使用逐渐受到限制。这一现象主要源于对Lumpfish福利状况的关注。尽管优化处理流程和操作标准是必要的，但改善饲料成分被认为是一个可能缓解慢性应激带来的负担的有效手段。本研究探讨了不同水平的膳食支链氨基酸（BCAAs）和赖氨酸（Lys）对Lumpfish健康、免疫、应激反应、生长和血浆氨基酸谱的影响，持续了10周。研究发现，应激和代谢生物标志物（如皮质醇、乳酸、葡萄糖和甘油三酯）呈现出一些轻微但可测量的变化，例如在BCAAs和Lys含量较低的饲料组中，甘油三酯水平较低，而葡萄糖水平较高。此外，血浆氨基酸谱也显示出代谢差异。限制性Lys和BCAAs的饲料似乎会增加应激鱼的糖异生活性，提高血浆中的糖异生氨基酸水平。相比之下，富含Lys和BCAAs的饲料则提高了抗蛋白酶活性，并降低了血浆中的γ-氨基丁酸（GABA）浓度。这些发现表明，富含Lys和BCAAs的饲料可能提供重要的营养支持，使生物能够适应轻度的慢性应激。免疫营养策略可能成为改善慢性应激下动物福利的有效方法。

动物福利是一个复杂且极具争议的话题，尤其在生物科学领域。定义动物福利具有挑战性，因为其不仅涉及生理表现，还涵盖了动物的情感体验。随着科学在动物认知领域的进展，人们开始认识到动物的主观体验。过去，动物往往被视为纯粹的工具，但现代科学则促使社会重新审视动物的感受和需求。这种认知的转变使得动物福利问题更加紧迫。Lumpfish作为一种被广泛用于海鲈鱼养殖业的清洁鱼，其福利状况已成为一个亟需重新评估的焦点。Lumpfish的快速扩张并未伴随对其生物学和生理需求的充分了解，导致了严重的福利问题。例如，挪威食品与兽医局（NFSA）的一份报告显示，Lumpfish的年死亡率高达45%，一些农场甚至报告了100%的死亡率。这一情况在五年后仍未改善，最新的报告指出清洁鱼的死亡率甚至高达80-90%。这表明，尽管Lumpfish在养殖业中具有重要作用，但其福利状况的恶化已成为不可忽视的问题。

应激在水产养殖中普遍存在，其来源包括饲养方式、水体理化性质、处理过程以及不理想的饲料。尽管某些应激因素可能带来正面效果，但其他因素则可能导致不适应性的生理变化。这些变化会影响动物的整体健康。在硬骨鱼类中，当感知到应激时，会释放儿茶酚胺类激素，随后是皮质醇类激素如皮质醇。这些激素会改变能量动员和细胞迁移，使机体为即将到来的攻击做好准备。动物在应激后具备抵抗、应对和恢复潜在威胁的能力。然而，当应激源过于强烈或频繁时，如某些慢性应激因素，机体的健康状况会恶化。应激反应本身是一个高度耗能的过程，因此，养殖动物依赖于饲料的营养充足性，以获得必要的营养素，恢复体内平衡。因此，考虑到养殖动物的现实需求，优化饲料成分以满足其营养需求至关重要。

鱼类营养研究已显著提高了水产养殖动物的生产力和整体健康状况。从满足生物需求到免疫调节，研究在饲料策略方面发挥了重要作用。例如，过去曾有报告指出，鱼类养殖业中出现了白内障问题，部分通过调整饲料中的氨基酸（AA）含量得以缓解，如组氨酸，它是晶状体渗透调节的关键成分。氨基酸在许多生理过程中具有重要作用，不仅是蛋白质合成的构建块，还具有自身的生物活性。例如，色氨酸是血清素的前体，已被证明具有免疫调节和应激调节特性。因此，氨基酸在水产养殖营养学中获得了广泛关注。然而，有一组重要的必需氨基酸，即支链氨基酸（BCAAs；亮氨酸[Leu]、异亮氨酸[Ile]和缬氨酸[Val]），尽管它们在多种生理过程中至关重要，但在免疫营养研究中却很少受到关注。BCAAs对于蛋白质合成和能量代谢至关重要，参与细胞修复和代谢通路的调节。另一重要的氨基酸是赖氨酸（Lys），它通常在水产饲料中是第一种限制性氨基酸，对于维持健康组织、免疫功能和应激适应能力具有重要意义。我们的先前研究表明，慢性应激显著影响了Lumpfish对BCAAs和Lys的利用，为本研究提供了直接的证据，证明了应针对这些氨基酸进行研究。

本研究采用了一种实验设计，将Lumpfish分为六个组，包括两个对照组。其中，负对照组“CTR-”在整个实验过程中保持未受干扰，并以商业饲料喂养。正对照组“CTR+”每周接受四次空气暴露，并同样以商业饲料喂养。四个实验组分别以不同的BCAAs和Lys含量喂养，包括组“A”、“B”、“C”和“D”。每个水箱被视为一个实验单位。实验分为两个阶段，总共持续10周，反映了评估慢性应激对代谢和免疫影响的现实设置。在第一阶段，即实验前两周，各组未受到干扰，仅以各自的饲料喂养。在第一阶段结束后，进行了第一次采样，并开始第二阶段的应激暴露。此时，组“CTR”被分为两组，“CTR-”保持未受干扰，“CTR+”则每周接受四次空气暴露。第二次采样在应激暴露开始后的第四周进行，第三次采样则在第八周进行。每个时间点评估三只鱼。

实验饲料由Skretting公司设计和制造，通过调整BCAAs和Lys的含量来改变其组成。表1列出了各组饲料的成分。对照饲料是Skretting公司生产的一种商业饲料，提供了标准的BCAAs和Lys含量。组A的BCAAs和Lys含量减少了约15%，而组B、C和D的含量则增加了约30%、60%和90%。这种氨基酸含量的变化是通过调整特定蛋白质成分的含量实现的。

健康和生长指标在每个采样点进行评估。此外，在鱼类到达研究设施时也进行了初始健康筛查。健康评分在每个采样点进行，依据Lumpfish健康评分系统（LHSS）进行。LHSS评分分为三个类别：低于3分表示良好的福利状态；3到5分之间表示关注的福利状态；高于5分则被视为福利受损。白内障评分使用便携式裂隙灯进行，计算其发生率。特定生长率（SGR）通过计算最终体重和初始体重的自然对数差来评估，乘以100并除以天数。白内障大小评分反映了白内障覆盖眼晶体的面积（1-4，其中“1”表示白内障覆盖不超过10%的眼晶体，“4”表示覆盖超过90%的眼晶体）。

在每个采样时间点，从每个水箱中随机选取3条Lumpfish（共9条鱼）进行安乐死，使用1600 mg/L的甲基磺酸甲苯胺（metacaine），遵循Sk?r等人（2017）的建议。采血过程在每条鱼上耗时不到1分钟，从尾静脉抽取至含有肝素的真空采血管（BD，英国）。血浆通过在4°C下以2000 x g离心5分钟获得。我们还建立了每组每水箱的血浆池（120 μL），以分析游离氨基酸。血浆样本立即在液氮中冷冻，并储存在-80°C。

皮质醇水平在血浆中测量，使用商业试剂盒（DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit，美国Arbor Assays Inc.）。混合和加入微孔板后，按照试剂盒制造商的协议进行操作。Spinreact试剂盒（西班牙Spinreact）用于量化代谢生物标志物：葡萄糖、乳酸和甘油三酯。使用Costas等人（2011）的协议进行微孔板操作。

抗蛋白酶活性的测定采用了Quade和Roth（1997）描述的协议。该比色法结果以单位蛋白酶表示，即需要多少单位的蛋白酶才能使吸光度变化1 OD。血浆溶菌酶的测定遵循Ellis（1990b）的方案，并根据Costas等人（2011）的适应性协议进行。血浆的总体杀菌能力按照Graham和Secombes（1988）的方法进行测定，由Machado等人（2015）的适应性方法进行验证。该方法包括将血浆与特定细菌（如Tenacibaculum maritimum）孵育，以评估其杀菌活性。硝酸盐（NO）通过比色法间接评估，使用Roche诊断试剂盒（德国），该试剂盒量化NO降解后的总硝酸盐和亚硝酸盐含量。

我们分析了每组每水箱的血浆游离氨基酸（FAA）。通过超高效液相色谱法（UPLC）进行，使用Waters Reversed-Phase氨基酸分析系统。Norvaline作为内标物。通过离心超滤（10 kDa切割孔径，2500 x g，20分钟，4°C）去除样品中的蛋白质，然后按照AccQ Tag方法（Waters，美国）进行预柱衍生化，使用AccQ Fluor试剂（6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯）。氨基酸的谱图通过标准混合物和纯标准物的保留时间建立。

统计分析采用Levene的F检验和Kolmogorov-Smirnov检验来检验方差齐性和正态性。对于偏态数据，进行了对数变换。对于不遵循正态分布的数据，采用非参数检验。每个组被分配3个重复水箱（n=3），除了在第2周的对照组CTR（n=6）。每个水箱在统计分析中被视为一个实验单位。由于实验设计，在第2周和第6周进行了一次方差分析，以解决对照组之间的效应。随后，采用Tukey HSD事后检验进行分析。所有统计测试均使用IBM SPSS v28.0（美国IBM Corp.）进行。显著性水平（α）为0.05，除非另有说明。

研究结果表明，皮质醇水平在各组之间没有显著差异，且在所有采样时间点均低于50 ng ml?1。甘油三酯的检测结果显示，在第6周，组A与组C和组D之间存在显著差异。其他时间点的对照组之间和饲料处理组之间均未发现显著差异。乳酸水平在整个实验中均无显著差异。然而，血浆中的葡萄糖水平在第6周时，组A的葡萄糖水平最高（1.70 ± 0.17 mM），显著高于组B（1.16 ± 0.06 mM）和组C（1.14 ± 0.07 mM）。在第10周时，组CTR-的葡萄糖水平显著高于组CTR+。

抗蛋白酶活性在第6周时，组D的活性显著高于组CTR+和组A。硝酸盐（NO）的检测在第6周时，组A的NO浓度显著高于组C。在第6周，组CTR+的NO水平显著高于未受干扰的对照组CTR-。这些结果表明，饲料中的BCAAs和Lys含量对Lumpfish的应激和免疫反应有显著影响。

血浆中的游离氨基酸谱分析显示，组A的血浆中Lys和BCAAs的含量较低，导致了代谢补偿机制的出现，鱼体可能转向其他能量来源，如脂质。同时，组A的血浆中发现较高的谷氨酸（Glu）和甘氨酸（Gly）含量，这可能表明代谢应激反应的增强。此外，组D的GABA水平显著低于组CTR+，这可能意味着组D的鱼在应激下更有效地利用了BCAAs和Lys，从而降低了对GABA的依赖。这表明，富含BCAAs和Lys的饲料可能有助于维持代谢平衡，降低对应激反应的依赖。

在实验过程中，健康和生长指标的变化表明，组A的鱼在第6周时生长率和体重显著低于组B。然而，在第10周时，受应激的组之间生长率和体重没有显著差异。组CTR-的鱼在第10周时生长率和体重显著高于受应激的组CTR+。这表明，虽然慢性应激会影响生长，但富含BCAAs和Lys的饲料可以支持鱼类在慢性空气暴露下的生存能力，而不影响其生长。此外，组A的鱼在第10周时白内障发生率显著高于其他组，这可能表明BCAAs和Lys的不足影响了眼部健康。

本研究的结果表明，优化饲料成分，特别是增加BCAAs和Lys的含量，可以有效缓解Lumpfish在慢性应激下的代谢和免疫负担。尽管传统应激生物标志物如皮质醇水平未见显著变化，但代谢和免疫指标的变化显示了慢性应激对鱼类生理的深远影响。通过调整饲料中的氨基酸组成，可以为鱼类提供必要的营养支持，帮助其维持代谢平衡和免疫功能。这一研究为水产养殖业提供了新的思路，即通过免疫营养策略改善动物福利，同时确保其健康和生产性能。然而，未来的研究需要进一步探索这些营养干预措施在商业规模下的应用，以及它们对鱼类健康和生存的具体影响。此外，还需关注饲料成本效益和营养成分之间的相互作用，以确保其在实际生产中的可行性。