纳米等离子体实时RT-RPA和CRISPR/Cas12a检测技术用于快速即时分子诊断

《Biosensors and Bioelectronics》：Nanoplasmonic real-time RT-RPA and CRISPR/Cas12a detection for rapid point-of-care molecular diagnostics

　　紧凑型光热纳米腔平台实现单次反应实时RPA与CRISPR/Cas12a联检，25分钟检测SARS-CoV-2 E基因达25.7拷贝/试卡，与RT-qPCR符合度100%。

　　这篇研究介绍了一种手掌大小的集成式等离激元光热平台，用于在点对点（point-of-care, POC）环境中实现实时芯片上的重组酶聚合酶扩增（RPA）和CRISPR/Cas12a检测。该平台结合了先进的纳米制造技术、高效的光热加热机制以及实时荧光成像功能，为分子诊断提供了一种更加紧凑、高效和低成本的解决方案。

### 技术背景与研究意义

分子诊断技术在现代医学中扮演着至关重要的角色，特别是在疾病早期发现和快速诊断方面。传统的诊断方法通常依赖于实验室环境，不仅耗时较长，而且成本高昂，限制了其在资源有限或需要快速响应的场景中的应用。因此，开发一种能够在现场进行快速、精准检测的便携式诊断工具成为研究的重点。

CRISPR/Cas技术因其高特异性、高灵敏度和操作简便的特点，被广泛应用于分子诊断领域。然而，CRISPR/Cas检测方法通常需要对目标核酸进行扩增，以提高检测的灵敏度。而现有的扩增方法，如聚合酶链式反应（PCR）等，往往需要复杂的设备和较长的反应时间，难以满足快速诊断的需求。相比之下，RPA是一种能够在较低温度下进行等温扩增的分子诊断技术，它不仅避免了PCR所需的高温循环，还能在短时间内完成扩增反应，从而加快诊断速度。

为了进一步提升检测效率，研究者们尝试将RPA与CRISPR/Cas检测技术相结合，形成一种“一站式”诊断方案。然而，这一结合仍然面临一些技术挑战，例如反应条件的控制、检测信号的获取以及设备的便携性。特别是，在现场检测中，传统的检测方法往往需要外部设备或复杂的操作流程，限制了其在实际应用中的可行性。

因此，本研究提出了一种新型的等离子光热平台，该平台能够在芯片上实现RPA和CRISPR/Cas12a的实时检测。通过结合等离激元光热加热和微流控芯片技术，该平台不仅能够实现高效的扩增反应，还能在短时间内完成目标核酸的检测，同时减少了对大型设备的依赖，提高了检测的便携性和实用性。

### 平台设计与工作原理

该平台的核心在于等离子光热加热技术的应用。传统的加热方法，如电热垫、加热袋或Peltier元件，虽然在实验室环境中具有一定的优势，但在现场使用时往往面临温度波动、热分布不均和高能耗等问题。而等离激元光热加热技术则能够提供快速、均匀的温度控制，同时具有低功耗和紧凑的结构，非常适合用于便携式诊断设备。

该平台采用了一种超薄等离子光热纳米腔（PNC）结构，由高度密集且随机分布的金纳米岛（AuNIs）和铝反射层组成，中间夹有一层薄氧化层。这种结构能够在白光LED（WLED）照射下实现高效的宽带吸收和内部反射，从而产生均匀且大面积的光热加热效果。PNC的结构设计不仅提高了加热效率，还确保了在芯片上进行RPA和CRISPR/Cas12a反应时的温度稳定性。

在芯片上，RPA和CRISPR/Cas12a反应在同一微室中进行。RPA通过重组酶与引物的相互作用，对目标DNA进行扩增。在扩增过程中，重组酶会解开双链DNA（dsDNA），使其变为单链DNA（ssDNA），而单链DNA结合蛋白（SSB）则会紧紧包裹单链DNA，以保持其稳定性。随后，DNA聚合酶会延伸引物，合成新的DNA链，从而实现指数级扩增。在扩增的同时，CRISPR/Cas12a系统会识别扩增后的DNA中的互补序列，并激活其转切割功能，将带有荧光标记的ssDNA报告分子切割，释放出荧光信号。

为了实现实时检测，该平台配备了一种微透镜阵列（FMLA）相机，能够在较短的工作距离内持续记录荧光信号。这种相机不仅提高了检测的灵敏度，还减少了对大型检测设备的依赖，使得整个系统更加紧凑和便携。通过这种方式，研究人员能够在短时间内完成对目标核酸的检测，并且能够实时监控反应过程，提高诊断的准确性和可靠性。

### 技术优势与应用前景

与现有的诊断平台相比，该平台具有以下几个显著优势。首先，其紧凑的结构使得设备更加便于携带和使用，特别适合用于现场检测。其次，该平台能够实现高效的光热加热，确保反应条件的稳定性，同时减少了对外部电源的依赖，提高了能源效率。第三，该平台能够在短时间内完成检测，大大缩短了分析时间，提高了诊断效率。第四，该平台能够实现多目标的同时检测，为复杂疾病的诊断提供了更多可能性。

此外，该平台还能够显著降低试剂的使用量和样本的体积，从而减少污染风险，提高检测的准确性。同时，由于反应过程在芯片上进行，避免了传统检测方法中可能存在的多步骤操作和复杂设备的需求，使得整个检测流程更加简单和高效。

在实际应用中，该平台可以用于多种疾病的快速诊断，特别是在传染病防控、个性化医疗和现场医学监测等领域。例如，在新冠疫情期间，快速、精准的检测对于疫情的防控至关重要。该平台能够在短时间内完成对SARS-CoV-2 E基因的检测，且检测结果与RT-qPCR一致，具有较高的可靠性。

此外，该平台还可以用于癌症早期筛查、基因表达分析以及单细胞检测等生物医学领域。在这些领域中，快速、精准的分子诊断技术能够帮助研究人员更快地获取生物样本的信息，从而为疾病的早期发现和治疗提供支持。

### 技术实现与实验验证

为了实现这一平台，研究人员采用了先进的纳米制造技术，对AuNIs和Al反射层进行了精确的结构设计。通过多次固态退蚀工艺，研究人员在4英寸的硼硅酸盐玻璃基板上制备了高度密集且随机分布的AuNIs。随后，通过等离子增强化学气相沉积（PECVD）技术，在AuNIs表面沉积了一层100纳米厚的二氧化硅（SiO?）。最后，通过热蒸发技术，在SiO?层上沉积了一层150纳米厚的铝薄膜，以实现光的反射和热的传导。

在实验中，研究人员使用该平台对42个临床样本进行了检测，包括SARS-CoV-2 E基因的检测。实验结果显示，该平台能够在25分钟内完成检测，且在每个芯片上能够检测到25.7个拷贝的病毒核酸，检测结果与RT-qPCR一致，准确率高达100%。这表明该平台在实际应用中具有较高的灵敏度和准确性。

此外，研究人员还测试了该平台在不同环境条件下的性能。实验结果显示，该平台能够在常温下实现稳定的光热加热，避免了传统加热方法中可能出现的温度波动和热分布不均的问题。同时，该平台的能耗较低，适合用于现场检测。

### 结论与未来展望

本研究成功开发了一种手掌大小的集成式等离子光热平台，用于在点对点环境中实现实时芯片上的RPA和CRISPR/Cas12a检测。该平台不仅能够提供快速、均匀的温度控制，还能在短时间内完成对目标核酸的检测，提高了诊断的效率和准确性。通过结合微流控芯片技术和实时荧光成像功能，该平台能够实现多目标的同时检测，为复杂疾病的诊断提供了更多可能性。

未来，该平台有望在更广泛的生物医学领域中得到应用，包括癌症筛查、基因表达分析以及现场医学监测等。此外，随着技术的不断进步，该平台还可以进一步优化，以提高检测的灵敏度和准确性，同时降低成本，使其更加适用于资源有限的地区。

总之，这项研究为分子诊断技术的发展提供了一个新的方向，特别是在现场检测和快速诊断方面。通过结合等离子光热加热和微流控芯片技术，研究人员开发了一种更加紧凑、高效和低成本的诊断平台，为未来的医疗实践提供了重要的技术支持。