衰老诱导的间充质基质细胞脂质组变化

《Journal of Proteome Research》：Senescence-Induced Lipidome Alterations in Mesenchymal Stromal Cells

　　本研究通过UHPLC-MS分析人骨髓间充质干细胞（MSCs）体外培养12天的脂质组学变化，发现长链高不饱和脂肪酸甘油三酯（TG）丰度与SA-β-gal阳性细胞比例呈正相关，并构建了基于TG的预测模型，为MSC规模化生产中的早期衰老监测提供新工具。

　　本研究探讨了人类间充质干细胞（MSCs）在体外培养过程中脂质代谢的变化，并尝试通过这些变化来预测MSCs的衰老水平。MSCs因其在多种疾病治疗中的潜力而备受关注，但它们在体外培养过程中容易发生衰老，这不仅限制了细胞的扩增能力，也影响了其治疗效果。因此，了解MSCs在衰老过程中的代谢特征，对于优化MSCs的生物制造流程以及确保临床应用中的细胞质量具有重要意义。

研究采用了一种高通量的脂质组学分析方法，结合超高效液相色谱-质谱联用技术（UHPLC-MS），对MSCs在连续三次传代过程中的脂质组成进行了系统评估。研究对象为来自两个不同供体的MSCs，研究者通过染色法检测了衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）的活性，以此衡量衰老细胞的比例。结果显示，在12天的培养过程中，衰老细胞的比例在不同供体之间存在显著差异。例如，Donor 182的MSCs在第8至12天表现出明显的衰老趋势，而Donor 310的MSCs则在第12天才开始显著增加衰老细胞的比例。这种差异表明，MSCs的衰老过程在不同个体之间具有一定的异质性。

为了更全面地分析MSCs的脂质变化，研究者利用精确质量数和串联质谱（MS/MS）光谱数据库比对的方法，共识别出237种独特的脂质注释。这些脂质包括磷脂酰胆碱（PCs）、鞘磷脂（SMs）、磷脂酰乙醇胺（PEs）以及三酰甘油（TGs）等。研究发现，尽管供体之间存在差异，但某些脂质的变化具有普遍性，能够区分衰老比例低于10%、介于10%-20%以及高于20%的MSCs培养样本。这些具有显著区分能力的脂质中，有12种，其中包括4种TGs。值得注意的是，TGs中含有长链和高度不饱和脂肪酸的成分，与MSCs的衰老水平密切相关。这一发现为未来监测MSCs在培养过程中的早期衰老提供了新的思路。

通过进一步的分析，研究者发现TGs的丰度在衰老过程中呈现出显著的上升趋势，而其他脂质类别的变化则较为复杂。特别是，TGs的增加与细胞体积的扩大有关，这可能是由于衰老细胞需要更多的膜脂质来维持其功能。此外，TGs的增加还可能与细胞应对氧化应激的机制相关，因为不饱和脂肪酸容易被氧化，将这些脂肪酸储存在脂滴中可以减少对细胞膜的损伤。这一假设与之前在其他细胞类型（如成纤维细胞）中的研究结果一致，即衰老过程中TGs和鞘三己糖苷（Hex3Cer）的代谢会增加。

为了验证这些发现，研究者对同一供体的MSCs进行了第二次独立的培养和脂质组学分析。结果表明，TGs的丰度与衰老细胞的比例之间存在稳定的关联，且这一关系在两个供体中均得到了支持。通过构建基于TGs的偏最小二乘回归（PLSR）模型，研究者能够准确预测MSCs培养样本中的衰老比例，且模型的预测能力与使用所有脂质注释的模型相当。这表明TGs可以作为MSCs衰老的可靠生物标志物。

在讨论部分，研究者指出，尽管脂质组学分析能够有效区分不同衰老水平的MSCs培养样本，但目前的研究仍存在一定的局限性。首先，研究主要基于群体水平的脂质代谢分析，未能深入揭示个体细胞层面的变化。这意味着，虽然可以利用脂质代谢特征来评估整个培养批次的衰老水平，但无法确定这些变化是否特异性地发生在衰老细胞中。因此，未来的研究可以结合单细胞脂质组学技术，进一步探讨衰老细胞与非衰老细胞在脂质代谢上的差异。

其次，研究者强调，由于MSCs在不同批次之间可能存在显著的异质性，因此需要更多的样本量和不同的供体来源来验证这些脂质标志物的普适性。尽管目前的实验结果表明TGs在两个供体中均能作为衰老的指标，但为了确保其在更广泛人群中的适用性，还需要在更多供体和批次中进行测试。此外，研究者还提到，其他脂质类别（如PCs和SMs）的变化也与衰老相关，但它们的表达模式在不同供体之间存在差异，这可能与个体的遗传背景和细胞环境有关。

研究还指出，TGs在细胞膜以外的其他功能中也扮演重要角色。例如，TGs不仅是能量储存的重要形式，还参与细胞信号传导、炎症反应以及免疫调节等多种生物学过程。因此，研究者推测，TGs的增加可能不仅是衰老细胞的被动反应，还可能是细胞主动调节自身代谢以应对衰老相关压力的一种策略。这种调节可能有助于维持细胞的稳定性，同时减少衰老对细胞功能的负面影响。

在实验方法上，研究者采用了严格的样品处理和分析流程，以确保数据的准确性和可重复性。MSCs在培养过程中被定期收获，并通过液氮冷冻保存，以备后续分析。在脂质提取阶段，使用了异丙醇作为溶剂，同时加入了内标物以提高检测的灵敏度和准确性。提取后的样品经过真空浓缩和冷冻保存，直到进行LC-MS分析。在分析过程中，研究者通过数据依赖采集（DDA）模式获取了脂质的碎片光谱，并利用Compound Discoverer软件对原始数据进行了处理，包括保留时间对齐、峰检测、峰面积积分以及基于质量控制（QC）样本的校正。

为了评估脂质变化与衰老水平之间的关系，研究者使用了PLSR和PLS-DA等统计方法。PLSR模型能够根据脂质的丰度预测衰老细胞的比例，而PLS-DA模型则用于区分不同衰老水平的样本。通过这些模型，研究者能够识别出哪些脂质在衰老过程中发生了显著变化，并进一步探讨这些变化的生物学意义。例如，TGs的增加与细胞体积的扩大和氧化应激的应对机制相关，而鞘三己糖苷（Hex3Cer）的增加则可能反映了细胞在衰老过程中对某些代谢途径的调整。

此外，研究者还分析了不同脂质链长和不饱和度对衰老水平的影响。结果显示，较长链和高度不饱和的TGs与更高的衰老比例显著相关。这一趋势在两个供体的MSCs中均得到了验证，表明TGs的结构特征可能与衰老过程存在直接联系。通过双键当量与碳数（DVC）图的分析，研究者发现，随着衰老程度的增加，TGs的不饱和度也相应提高，这可能意味着细胞在衰老过程中倾向于将更多的不饱和脂肪酸储存在脂滴中，以减少对细胞膜的潜在损害。

在研究的意义方面，本研究的发现为MSCs的生物制造和临床应用提供了重要的参考。通过监测脂质代谢的变化，特别是TGs的丰度，可以更早地识别培养过程中可能出现的衰老问题，从而优化培养条件，提高MSCs的治疗效果。此外，这些脂质标志物还可以用于质量控制和批次筛选，帮助生产团队确保最终产品的稳定性与有效性。

本研究的局限性在于，目前的分析主要基于群体水平的脂质代谢数据，无法提供单个细胞层面的详细信息。因此，未来的研究可以结合单细胞脂质组学技术，进一步探讨衰老细胞与非衰老细胞在脂质代谢上的差异。同时，研究者还建议，通过更多的供体和批次测试，可以更全面地验证这些脂质标志物的普适性，并探索它们在不同培养条件下的表现。

总的来说，本研究通过高分辨率质谱技术揭示了MSCs在衰老过程中的脂质代谢变化，并发现TGs是与衰老水平密切相关的可靠指标。这些结果不仅加深了我们对MSCs衰老机制的理解，也为优化MSCs的培养和应用提供了新的思路。未来的研究可以进一步探索这些脂质标志物在临床治疗中的具体作用，以及如何利用它们来提高MSCs的治疗效果和安全性。