Nocturnin基因的缺失能够在氧化应激条件下提高神经细胞的存活率

《Frontiers in Neuroscience》：Loss of Nocturnin increases neuronal viability in oxidative stress conditions

　　氧化应激失衡是帕金森病等神经退行性疾病的核心机制，Nocturnin作为NADP(H)磷酸酶通过调控NADPH水平影响抗氧化代谢。本研究发现敲除Nocturnin显著提升细胞内总谷胱甘肽水平，增强抗氧化能力，降低ROS和脂质过氧化损伤，在体外CAD细胞及体内DA_SYN53小鼠模型中均证实其保护多巴胺能神经元的作用。

　　本研究探讨了Nocturnin在神经退行性疾病（NDDs）中对氧化应激介导的神经元损伤的潜在影响，尤其是帕金森病（PD）。通过在体外和体内实验中分析Nocturnin缺失对细胞存活和氧化应激水平的影响，研究揭示了Nocturnin在调节氧化应激中的关键作用。这些发现不仅加深了我们对Nocturnin功能的理解，也为开发新的神经退行性疾病的治疗策略提供了重要线索。

### 氧化应激与神经退行性疾病

神经退行性疾病是一类以神经元逐渐退化和死亡为特征的疾病，其发展过程复杂且多因素参与。氧化应激是这些疾病中一个普遍存在的现象，其核心在于活性氧（ROS）与抗氧化剂之间的失衡。ROS的积累会对细胞造成损害，影响线粒体功能、蛋白质折叠和细胞膜完整性，从而导致神经元死亡。帕金森病作为最常见的神经退行性疾病之一，其病理特征之一是黑质致密部（SNc）的多巴胺能神经元显著退化，随后影响到腹侧被盖区（VTA）和皮质区域。多巴胺代谢过程中产生的ROS及其有毒副产物，进一步加剧了氧化应激，促进了α-突触核蛋白的聚集，而α-突触核蛋白的异常积累被认为是帕金森病进展的重要因素之一。

在神经退行性疾病的背景下，抗氧化剂如谷胱甘肽（GSH）在维持细胞氧化还原平衡方面起着至关重要的作用。GSH是一种在大脑中广泛存在的抗氧化剂，能够中和ROS并维持细胞内环境的稳定。然而，帕金森病患者的GSH水平通常显著降低，这使得神经元更容易受到氧化应激的损害。此外，NADPH在维持抗氧化系统中也发挥着关键作用，它不仅是GSH再生过程中的关键辅因子，还参与了多种细胞内反应，帮助维持细胞健康。因此，NADPH水平的降低会增加细胞对氧化应激的敏感性，进而导致细胞死亡。

### Nocturnin的功能与氧化应激

Nocturnin是一种NADP(H)磷酸酶，其主要功能是将NADP(H)转化为NAD(H)。虽然Nocturnin的磷酸酶活性已被广泛研究，但其在神经退行性疾病中的具体作用尚不明确。在一些非神经细胞系中，Nocturnin的过度表达会导致NADP(H)水平下降，从而增加细胞对氧化应激的敏感性，而Nocturnin的缺失则表现出保护作用。这些发现表明，Nocturnin可能通过调节NADPH水平，间接影响细胞的抗氧化能力。

在帕金森病患者的大脑中，Nocturnin的表达水平在多巴胺神经元中显著升高，这可能与其在氧化应激中的作用有关。此外，在慢性左旋多巴治疗引发的运动障碍模型中，Nocturnin的表达也增加。这些结果提示Nocturnin可能在多巴胺代谢过程中发挥一定的调节作用，从而影响神经元的抗氧化能力。然而，其具体机制仍需进一步研究。

### 体外实验：Nocturnin缺失对CAD细胞的影响

为了进一步探讨Nocturnin在神经元中的作用，研究者选择了Cath.a-分化（CAD）细胞作为模型。CAD细胞是一种具有神经元和多巴胺能特性的细胞系，能够模拟多巴胺神经元的某些特性，如表达酪氨酸羟化酶（TH）和具有神经元形态。研究者通过构建Nocturnin敲低（shNoct）细胞系，观察其在氧化应激条件下的反应。

在基础条件下，Nocturnin缺失的CAD细胞表现出更高的NADPH水平，这可能与Nocturnin作为NADP(H)磷酸酶的活性有关。在氧化应激条件下，如使用过氧化氢（H?O?）处理，Nocturnin缺失的细胞仍能维持较高的NADPH水平，而野生型（WT）细胞的NADPH水平显著下降。这种差异表明，Nocturnin的缺失可能通过增强NADPH的稳定性，间接提高细胞的抗氧化能力。此外，研究者还发现，Nocturnin缺失的CAD细胞在H?O?处理后表现出更高的细胞存活率，这可能与其更高的抗氧化水平有关。

为了验证Nocturnin的缺失是否通过其磷酸酶活性影响细胞存活，研究者进一步进行了Nocturnin的过表达实验。他们使用了一种突变体Nocturnin（E193A），该突变体无法发挥磷酸酶活性。结果显示，过表达E193A Nocturnin的细胞与Nocturnin缺失的细胞在细胞存活率上无显著差异，这表明Nocturnin的缺失对细胞存活的保护作用主要来自于其磷酸酶活性的丧失，而非其表达水平的变化。

### 体内实验：Nocturnin缺失对PD小鼠模型的影响

为了进一步验证Nocturnin在神经退行性疾病中的作用，研究者利用了一种过表达突变α-突触核蛋白A53T的帕金森病小鼠模型（DA_SYN53）。该模型通过特定的基因表达系统（tet-off）实现α-突触核蛋白的过表达，而Nocturnin的缺失则通过基因敲除技术实现。研究者发现，在6个月大的DA_SYN53小鼠中，Nocturnin的缺失显著增加了多巴胺能神经元的存活率。

具体而言，研究者通过免疫组化和无偏立体学计数技术，对小鼠黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）的多巴胺能神经元进行了分析。结果显示，DA_SYN53小鼠在6个月时，其多巴胺能神经元数量显著减少，而DA_SYN53; Nocturnin?/?小鼠的多巴胺能神经元数量则显著增加。这一结果表明，Nocturnin的缺失在体内条件下也具有保护作用，能够减缓多巴胺能神经元的退化。

此外，研究者还观察到Nocturnin缺失的小鼠在某些情况下表现出更高的谷胱甘肽水平。谷胱甘肽的合成依赖于多种代谢途径，包括经典途径和替代途径（如转硫途径）。研究者通过代谢组学分析，发现Nocturnin缺失的CAD细胞在基础和氧化应激条件下，多种与谷胱甘肽合成和氧化应激反应相关的代谢物水平显著增加。例如，支链氨基酸（BCAAs）如缬氨酸和异亮氨酸的水平升高，这些氨基酸在抗氧化过程中发挥重要作用。此外，胆碱代谢途径的某些代谢物也表现出显著变化，提示Nocturnin的缺失可能通过影响多个代谢途径来增强细胞的抗氧化能力。

### 氧化应激与神经元存活的关系

研究者进一步探讨了Nocturnin缺失对氧化应激相关指标的影响。通过测量ROS水平、脂质过氧化产物（如TBARS）和谷胱甘肽（GSH/GSSG）的比例，研究者发现Nocturnin缺失的CAD细胞在氧化应激条件下表现出更低的ROS积累和更高的GSH/GSSG比值。这些结果表明，Nocturnin的缺失能够通过增强抗氧化系统，减少氧化应激对神经元的损害。

在体内实验中，研究者还发现Nocturnin缺失的DA_SYN53小鼠表现出更高的多巴胺能神经元存活率。这可能与Nocturnin缺失后，NADPH水平的升高有关，因为NADPH是维持抗氧化系统的关键辅因子。此外，研究者还观察到Nocturnin缺失的小鼠中，α-突触核蛋白的表达水平有所变化，这可能表明Nocturnin在调控α-突触核蛋白的代谢中也起到一定作用。然而，这一现象的具体机制仍需进一步研究。

### 潜在的治疗意义

研究结果表明，Nocturnin的缺失能够通过增加NADPH和谷胱甘肽水平，增强细胞对氧化应激的抵抗力。这一发现为开发新的帕金森病治疗方法提供了思路。目前，帕金森病的治疗主要依赖于药物干预和生活方式调整，而Nocturnin作为NADP(H)磷酸酶，其功能可能为新的治疗靶点。通过调控Nocturnin的表达或活性，可能有助于改善神经元的抗氧化能力，从而减缓疾病进展。

此外，研究还提示Nocturnin可能在昼夜节律调节中发挥重要作用。Nocturnin在小鼠中具有明显的昼夜节律表达，其活性可能与细胞内的氧化还原状态密切相关。昼夜节律的紊乱与帕金森病的进展有关，而Nocturnin的缺失可能有助于恢复细胞内的氧化还原平衡。因此，未来的研究可以进一步探讨Nocturnin在昼夜节律调控中的作用，以及其对神经退行性疾病的影响。

### 未来研究方向

尽管本研究取得了重要的进展，但仍有一些局限性需要进一步探索。首先，CAD细胞虽然具有神经元特性，但无法产生多巴胺，这可能影响其对帕金森病的模拟效果。因此，未来的研究可以考虑使用更接近真实神经元的细胞系或组织模型，以更全面地评估Nocturnin在疾病中的作用。其次，本研究主要关注Nocturnin的缺失对氧化应激的影响，但Nocturnin的昼夜节律调控机制尚未完全阐明。未来的研究可以结合昼夜节律的分析，探讨Nocturnin在不同时间点对细胞抗氧化能力的影响。

此外，研究者还发现Nocturnin的缺失可能通过影响多个代谢途径来增强细胞的抗氧化能力，这为开发针对多种神经退行性疾病的综合治疗策略提供了可能性。例如，通过调节谷胱甘肽合成途径中的关键代谢物，或通过增强其他抗氧化途径，可能有助于提高细胞对氧化应激的抵抗力。

综上所述，本研究揭示了Nocturnin在氧化应激介导的神经元损伤中的关键作用。通过增强NADPH和谷胱甘肽水平，Nocturnin的缺失能够显著提高细胞的抗氧化能力，从而保护神经元免受氧化应激的损害。这些发现不仅加深了我们对Nocturnin功能的理解，也为开发新的神经退行性疾病治疗方法提供了重要的理论依据和实验支持。未来的研究可以进一步探索Nocturnin在昼夜节律调控中的作用，以及其对多种神经退行性疾病的影响，从而为疾病的预防和治疗提供更全面的视角。