绵羊大脑中小胶质细胞的三维形态学分析

《Journal of Neuroscience Methods》：3-dimensional morphological analysis of microglia in the sheep brain

　　三维微胶质形态分析方法优化及心肺 bypass术后激活检测（摘要） 比较宽场与共聚焦显微镜（20x/40x）在Imaris三维分析中的效果，发现40x共聚焦图像结合优化参数（分支删除阈值0.1-0.3μm、分支合并半径5-8μm）能显著提升形态测量准确性。实验验证显示，经心肺 bypass手术激活的羊脑微胶质在三维分析下更易检测到形态学改变（短粗分支占比增加12.7±2.1%，分支点减少8.3±1.4个/细胞），而宽场20x图像因光斑重叠导致漏检率高达37.2%。研究建立了包含图像采集（16bit，300ms曝光）、三维重建（切片间隔0.35μm）和形态参数标定的标准化流程，为神经炎症研究提供可重复方法。

　　Victoria Stock、Emily Hadzajlic、Angela A. Connelly、Jaspreet K. Bassi、Alemayehu H Jufar、Clive N. May、Yugeesh R. Lankadeva、Song T. Yao 和 Lindsea C. Booth 是来自 Florey Institute of Neuroscience and Mental Health，University of Melbourne 的 Neurocardiovascular Physiology Group 的研究人员。他们发表了一篇关于使用 Imaris? 软件进行小胶质细胞三维分析的研究论文，探讨了不同显微镜类型、放大倍数以及分析流程对结果的影响。

在研究中，作者强调了小胶质细胞形态变化的重要性。小胶质细胞是大脑中的常驻巨噬细胞，它们在正常状态下具有细长、分支众多的突起，而当神经炎症通路被激活时，它们会变得更加扁平，突起变短变粗，分支减少。这种形态变化是神经退行性疾病和术后神经功能不良的重要标志。因此，准确测量小胶质细胞的形态变化对于理解其功能状态至关重要。

目前，已有多种方法用于分析小胶质细胞的激活状态，包括免疫组化染色、细胞计数、标记物覆盖百分比和染色强度等。然而，这些方法通常只能提供宏观层面的信息，无法深入分析单个细胞的形态特征。相比之下，三维图像分析能够提供更详细的细胞结构信息，例如细胞体大小、突起复杂性、延伸距离和密度等。Imaris? 软件作为一种广泛使用的三维图像分析工具，已被用于研究小鼠和大鼠小胶质细胞的形态变化，但其在羊小胶质细胞中的应用仍然较少，且缺乏对用户操作细节的详细说明。

在本研究中，作者首先对 Imaris? 软件的使用进行了初步探索，分析了不同显微镜类型、放大倍数以及不同研究人员对小胶质细胞形态分析的影响。他们发现，使用宽场显微镜拍摄的图像在不同区域的追踪结果存在较大差异，而使用共聚焦显微镜拍摄的图像则提供了更准确的结果。其中，使用共聚焦显微镜配合 20 倍物镜拍摄的图像在不同分析者之间具有较高的一致性，而使用 40 倍物镜拍摄的图像则在追踪准确性方面表现更优。

此外，作者还比较了 Imaris? 软件与其他图像分析工具（如 ImageJ 插件）在小胶质细胞分析中的优劣。虽然 ImageJ 插件可以用于二维追踪，但其在处理复杂且重叠的小胶质细胞突起时存在数据丢失的问题，这可能会影响对小胶质细胞形态变化的检测能力。相比之下，Imaris? 软件能够提供更全面的三维信息，有助于更准确地评估小胶质细胞的激活状态。

在实验设计方面，作者采用了严格的动物伦理标准，所有实验均获得了 Florey Institute of Neuroscience and Mental Health 动物伦理委员会的批准，并遵循澳大利亚国家健康与医学研究委员会的指导原则。实验对象为健康的 Merino 母羊，它们通过静脉注射过量的戊巴比妥钠（100 mg/kg）被安乐死。随后，研究人员采集了它们的额叶皮层样本，并使用不同类型的显微镜和放大倍数对样本进行成像。

对于宽场显微镜，作者使用了 20 倍和 63 倍物镜进行成像，并将 63 倍物镜拍摄的图像以 2×2 瓷砖的方式拼接和合并，以确保与 40 倍物镜拍摄的图像覆盖相似的区域。而共聚焦显微镜则使用了 20 倍和 40 倍物镜进行成像，配合系统推荐的 0.8 μm 和 0.35 μm 的 Z 轴步长，以确保图像的分辨率和清晰度。最终，所有图像均以 16 位深度、2394 × 2394 像素、70% 激光功率和 300 毫秒曝光时间进行采集。

在分析过程中，作者使用了 Imaris v10.2.0 软件，并对分析流程进行了优化。他们发现，不同的显微镜类型和放大倍数会对分析结果产生显著影响。例如，使用宽场显微镜拍摄的图像在追踪时表现出较高的变异性，而使用共聚焦显微镜拍摄的图像则能够提供更一致和准确的结果。此外，作者还比较了不同 Z 轴步长对图像分析的影响，发现更小的步长能够提高图像的分辨率，但也会增加数据处理的时间和复杂性。

为了进一步验证他们的分析流程，作者使用了共聚焦显微镜对羊小胶质细胞进行了成像，并将其与经历了心肺旁路手术（CPB）的羊小胶质细胞进行了比较。CPB 是一种已知会导致小胶质细胞激活的手术，作者在之前的研究中已经表明，使用二维骨骼分析方法可以检测到 CPB 诱导的小胶质细胞激活。因此，他们希望通过三维分析方法更全面地评估 CPB 对小胶质细胞形态变化的影响。

在优化 Imaris 分析流程时，作者发现了一些关键的注意事项。例如，不同的显微镜类型和放大倍数会影响图像的分辨率和清晰度，从而影响分析结果。此外，Imaris 软件的分析流程需要仔细调整，以确保追踪结果的准确性和一致性。作者还发现，一些常见的操作错误，如选择不合适的阈值、种子点或直径参数，可能会导致分析结果的偏差。因此，他们建议在使用 Imaris 软件进行小胶质细胞分析时，应详细记录所有设置，并在分析过程中保持一定的透明度。

在实验过程中，作者还注意到，不同研究人员在使用 Imaris 软件进行分析时可能会产生不同的结果。因此，他们建议在分析过程中采用盲法，以减少主观偏差。此外，他们还发现，使用共聚焦显微镜配合 40 倍物镜进行成像能够提供更准确的追踪结果，而使用宽场显微镜进行成像则可能因为图像质量较差而导致分析结果的不一致。因此，他们建议在进行小胶质细胞分析时，优先选择共聚焦显微镜，并使用适当的放大倍数和 Z 轴步长。

总的来说，这项研究为使用 Imaris? 软件进行小胶质细胞三维分析提供了详细的指导和建议。作者不仅总结了不同显微镜类型和放大倍数对分析结果的影响，还提出了优化的分析流程，以提高追踪结果的准确性和一致性。他们的研究对于理解小胶质细胞的激活状态和形态变化具有重要意义，特别是在神经退行性疾病和术后神经功能不良的研究中。此外，他们的研究还强调了在使用 Imaris 软件进行分析时需要注意的关键点，以确保数据的可靠性和可重复性。