利用β-环糊精和膨润土包覆的活性炭，无需预富集即可快速检测牡蛎中的单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的PCR方法

《Magnetic Resonance Imaging Clinics of North America》：Rapid PCR detection method of Listeria monocytogenes in oysters utilizing β-cyclodextrin and bentonite-coated activated charcoal without pre-enrichment

　　李斯特菌快速检测方法研究。采用β-环糊精和膨润土包覆活性炭预处理，结合PCR技术，无需预增富即可在4小时内完成对牡蛎中李斯特菌的检测，灵敏度达101 CFU/25g，特异性100%，试剂在-20℃下稳定保存至少一年。方法与国家标准GB 4789.30-2016检测结果一致，有效解决食品基质干扰问题，为海鲜安全监测提供新工具。

　　在当今食品安全日益受到重视的背景下，快速、准确且高灵敏度的检测技术对于保障公众健康具有重要意义。作为一种广泛存在于水生环境和多种食品中的病原菌，单核增生李斯特氏菌（*Listeria monocytogenes*）因其对人类健康的潜在威胁而成为食品安全监测的重点对象。尤其在贝类食品中，由于其滤食特性，单核增生李斯特氏菌容易在其体内积累，导致食源性李斯特菌病的发生。这种疾病不仅可能导致严重的胃肠道感染，还可能引发神经系统并发症，甚至导致孕妇流产和胎儿死亡，其致死率高达20%-30%。因此，开发一种高效且便捷的检测方法，以应对单核增生李斯特氏菌在贝类中的污染问题，对于提升食品安全和公共卫生安全至关重要。

传统的检测方法通常依赖于微生物培养技术，包括富集、分离、生化鉴定和血清学检测等步骤。这些方法虽然准确性和可靠性较高，但往往需要数天的时间才能完成，且操作复杂、耗时耗力，难以满足现代食品工业对快速检测的需求。此外，由于贝类样品中存在多种内源性抑制物，如蛋白酶、脂肪颗粒和多酚类化合物，这些物质可能会干扰PCR反应，从而影响检测的灵敏度和准确性。为了解决这些问题，研究人员提出了一种新的PCR检测方法，通过结合β-环糊精和膨润土包覆活性炭的预处理技术，以有效去除PCR抑制物并富集单核增生李斯特氏菌。

β-环糊精是一种具有疏水内腔和亲水外壁的环状寡糖，能够选择性地结合疏水性抑制物，从而减少对PCR反应的干扰。而膨润土包覆活性炭则利用其丰富的表面活性，吸附细菌细胞的同时避免对目标菌的直接吸附。这种方法的结合不仅能够显著提高检测的灵敏度，还能在无需预富集的情况下，缩短检测时间，提高检测效率。在本研究中，通过优化预处理条件，实现了对单核增生李斯特氏菌的高效富集和去除抑制物，从而确保PCR反应的顺利进行。

为了验证该方法的特异性和灵敏度，研究人员使用了193种细菌菌株，包括单核增生李斯特氏菌和其他非目标菌株。通过设计针对*inlB*基因的特异性引物，对所有菌株进行了PCR扩增实验。结果显示，所有单核增生李斯特氏菌菌株均能扩增出预期的279 bp片段，而其他非目标菌株则未产生扩增产物，表明该方法具有100%的特异性。此外，该方法在不同浓度的单核增生李斯特氏菌污染样品中均表现出良好的灵敏度，能够检测到低至10 CFU/25g的细菌浓度，且在重复实验中结果保持一致，进一步验证了其检测的可靠性和重复性。

在实际应用方面，研究人员对200份市售贝类样品进行了检测，并与国家标准方法GB 4789.30-2016进行了对比。结果显示，该PCR方法在检测率、检测时间和活菌回收率方面均与国家标准方法保持一致，同时检测时间大大缩短，仅需4小时即可完成，而国家标准方法通常需要6天。这表明该方法在实际应用中具有显著的优势，可以有效提升食品安全检测的效率。

此外，研究人员还评估了PCR试剂在-20°C下长期储存的稳定性。结果显示，试剂在储存3、6和12个月后仍能保持良好的性能，检测灵敏度达到10 CFU/25g，并且在10次重复实验中结果一致，表明其具有良好的稳定性和实用性。这一发现对于该方法在食品检测领域的推广和应用具有重要意义，尤其是在需要长期储存和运输的环境中。

该研究还讨论了该方法在实际应用中的局限性。例如，虽然该方法能够快速检测单核增生李斯特氏菌，但其无法区分活菌、死菌或受损菌细胞，这可能导致假阳性结果。此外，由于该方法依赖于PCR设备，设备成本可能较高。然而，随着PCR技术在食品检测领域的普及，这些设备在许多国家和地区已经较为常见，因此该方法在实际应用中仍然具有较高的可行性。

在讨论中，研究人员还比较了该方法与其他预处理技术的优缺点。例如，免疫磁珠分离（IMS）技术虽然能够快速去除PCR抑制物，但其检测灵敏度较低，且需要专门的设备。而纳米颗粒-IMS与实时PCR（qPCR）的结合虽然提高了检测灵敏度，但需要更长时间的预富集步骤，增加了检测时间。相比之下，β-环糊精和膨润土包覆活性炭的预处理方法操作简便、成本较低，并且能够在较短时间内完成检测，同时保持较高的灵敏度和特异性。

综上所述，该研究提出了一种基于β-环糊精和膨润土包覆活性炭的PCR检测方法，能够有效去除PCR抑制物并富集单核增生李斯特氏菌。该方法在特异性、灵敏度和检测时间方面均表现出色，适用于贝类样品的快速检测。同时，该方法在-20°C下长期储存仍保持稳定，为食品安全检测提供了新的技术支持。尽管该方法仍存在一些局限性，如无法区分活菌和死菌，但其简便、快速和高灵敏度的特点，使其在食品安全监测领域具有广阔的应用前景。未来的研究可以进一步优化该方法，拓展其应用范围，以适应更多种类的食品检测需求。