综述：精准基因疗法：针对遗传性视网膜营养不良（IRDs）定制rAAV介导的基因治疗方案

《Mitochondrion》：Precision gene therapy: Tailoring rAAV-mediated gene therapies for inherited retinal dystrophies (IRDs)

　　视网膜退行性疾病（IRDs）的基因治疗依赖rAAV向特定视网膜细胞精准递送，需结合capsid工程与调控元件优化。研究综述了靶向RGCs、双极细胞、Müller细胞及RPE的rAAV策略，包括基因增强（如Luxturna?）、编辑（CRISPR/Cas9、碱基编辑、Prime编辑）、RNA干扰及光遗传学等，并探讨了临床转化挑战与未来方向。

　　在研究遗传性视网膜营养不良（IRDs）的基因治疗中，腺相关病毒（AAV）作为一种基因传递工具，因其安全性和长期表达能力而受到广泛研究。这些疾病影响视网膜的不同细胞类型，包括视杆细胞、视锥细胞、双极细胞、视网膜神经节细胞（RGCs）以及视网膜色素上皮细胞（RPE）。尽管AAV在基因治疗中表现出色，但实现精准的细胞靶向和适当的转基因调控仍然是一个关键挑战。近年来，通过优化病毒衣壳蛋白和引入细胞类型特异性调控元件，研究者在提高rAAV介导治疗的精确度方面取得了显著进展。这些改良工具可以与多种治疗策略结合，如基因增强、基因编辑、RNA调控和光遗传学，以扩大治疗范围并提升疗效。本文综述了rAAV向量的定制进展，旨在实现针对不同细胞类型的精准基因治疗。

### 1. 引言

遗传性视网膜营养不良（IRDs）是一类罕见的遗传性疾病，其特点是多种视网膜细胞类型的退化，包括光感受器、Müller胶质细胞、双极细胞、RGCs和RPE。随着基因测序和基因分型技术的快速发展，以及对患者表型的深入研究，许多影响这些细胞功能的基因突变已被鉴定。目前，已知超过300种不同的突变基因与各种形式的视网膜营养不良有关。这一重要进展为研究疾病机制和开发治疗工具奠定了基础。在临床前研究中，多个疾病模型已被开发或自然发生，为评估基因治疗药物的安全性、分布、作用机制和疗效提供了宝贵的资源。然而，尽管药物开发迅速，某些动物模型可能无法完全复制人类表型，如Usher综合征和Stargardt病，这些是常见的罕见视网膜疾病。在这些情况下，使用人类诱导多能干细胞（iPSCs）和视网膜类器官可以揭示一些病理机制并测试新药。因此，针对特定视网膜细胞类型的基因治疗策略是治疗IRDs的关键。

### 2. 提供细胞特异性的要素

细胞特异性表达最终依赖于两个关键因素：一是rAAV能够转导目标细胞类型，二是存在调控元素以实现转基因的表达。首先，rAAV的转导特异性及效率受到其对细胞受体的亲和力、扩散能力以及给药途径（如亚视网膜或玻璃体注射）的影响。亚视网膜注射将治疗剂直接注入光感受器和RPE之间，从而在相对较低的病毒剂量下实现高效的转导，并减少全身暴露，从而降低脱靶效应和严重炎症。然而，这种侵入性方法可能对已经脆弱的视网膜造成物理应力或损伤，导致视网膜或RPE脱离和出血，需要高水平的手术技术。相比之下，玻璃体注射方法侵入性较小，技术更简单，但可能受到内层视网膜膜（ILM）等生理屏障的限制，从而影响光感受器和RPE的转导效率。此外，它还与较高的免疫原性和潜在的炎症、玻璃体炎、视网膜脱离等眼部不良事件有关。

除了给药途径，其他因素如中和抗体（NAbs）的存在和给药剂量也显著影响转导效率和特异性。其次，调控元件（CREs）如启动子、增强子和非翻译区（UTRs）决定了转基因在转导细胞中的表达水平和特异性。尽管像巨细胞病毒（CMV）增强子和鸡β-肌动蛋白（CBA）启动子等调控元件通常能驱动强烈的转基因表达，但它们在非特异性细胞中表达，可能降低治疗效果。因此，需要考虑疾病的病程以及转基因的生物功能，以确保其发挥预期的生理作用。本节简要描述了一些用于识别和优化rAAV衣壳和细胞特异性CREs的方法。

### 3. 视网膜特异性rAAV工具箱

本节重点介绍了用于实现视网膜特定细胞类型基因传递的rAAV衣壳和调控元件。这些例子并不涵盖所有可用的工具，但展示了衣壳选择和启动子设计如何用于靶向不同的视网膜细胞群体。表1总结了代表性rAAV血清型在不同物种中的转导偏好。同时，表2列出了调控序列，这些序列赋予转录特异性，说明了衣壳与特定启动子的组合如何优化转基因表达模式。

### 3.1 靶向视网膜神经节细胞（RGCs）

靶向RGCs的基因传递是一个活跃的研究领域，这在治疗青光眼或某些遗传性疾病如Leber遗传性视神经病变（LHON）方面具有重要应用潜力。LHON是由于线粒体编码的复合物I的亚基（如ND1、ND4和ND6）的有害突变导致的，这些突变会减少三磷酸腺苷（ATP）的产生，增加氧化应激水平，并导致RGCs的进行性丧失。RGCs的退化也是常染色体显性视神经萎缩（DOA）的标志。动态蛋白120kDa（OPA1）是一种位于线粒体内膜的蛋白质，其突变会改变多种细胞器功能，导致线粒体网络的碎片化和能量生产减少。此外，其他基因的突变也与不同的综合征性视神经萎缩有关。同样，通过光遗传学方法将RGCs转化为光敏感细胞也是一种潜在的策略。

### 3.2 靶向视网膜双极细胞

先天性静止夜盲症（CSNB）主要由于ON双极细胞中的谷氨酸能受体6通路的突变，导致在低光下视力严重受损。常见于CSNB的基因突变包括NYX、GRM6、GPR179、LRIT3、GNB3和TRPM1。由于光感受器的退化，双极细胞成为治疗的重要目标。通过光遗传学方法，这些细胞可以被转化为光敏感细胞。因此，针对双极细胞的基因表达调控工具具有重要价值。

### 3.3 靶向Müller细胞

某些IRDs源于Müller细胞功能障碍，例如某些形式的视网膜营养不良（RP）或Leber先天性黑蒙（LCA），这些疾病由Crumbs同源蛋白1（CRB1）的缺乏引起。此外，Müller细胞在促进生存因子传递或重新启动再生能力方面具有潜力，尤其是在低等哺乳动物中。因此，能够实现Müller细胞特异性表达的rAAV向量非常有用。

### 3.4 靶向光感受器

大多数IRDs影响视杆细胞和/或视锥细胞的功能，因此治疗需要定制的向量来特异性靶向这些细胞群体。例如，usherin（USH2A）基因的突变会影响视杆细胞和视锥细胞，而视杆细胞或视锥细胞特异性基因如rhodopsin（RHO）或视网膜鸟苷酸环化酶2D（GUCY2D）的突变则仅影响其中一种细胞。针对这些细胞的基因传递需要考虑不同的向量血清型和调控元件，以确保有效和特异的表达。

### 3.5 靶向视网膜色素上皮细胞（RPE）

某些遗传性视网膜营养不良直接影响或间接影响RPE细胞的功能。例如，LCA2是由RPE65缺乏引起的，RPE65是RPE细胞中合成视色素的关键酶。Bestrophinopathy是由VMD2基因突变引起的，该基因编码bestrophin-1蛋白，突变会改变RPE细胞的钙代谢，导致RPE-光感受器界面功能障碍。此外，一些研究表明，导致光感受器退化的突变在疾病晚期会导致RPE组织的显著改变，从而影响其结构和存活。因此，针对RPE细胞的基因传递策略对于某些形式的IRDs是重要的。

### 4. 基于rAAV的基因治疗技术

在本节中，我们回顾了基于rAAV的多种治疗策略，包括基因增强、基因编辑、RNA编辑、表观遗传编辑、RNA干扰和剪接调控。这些策略的优缺点及其在治疗IRDs中的应用将被详细讨论。

#### 4.1 基因增强

基因增强是基因治疗的经典方法，主要用于修复功能丧失型突变，通过递送功能正常的基因拷贝来恢复正常的蛋白质表达。2017年，Luxturna?（voretigene neparvovec）被批准用于治疗RPE65相关的视网膜营养不良，目前仍是唯一被批准用于IRDs的基因治疗产品。在该策略的基础上，其他临床试验也展示了有希望的结果。然而，恢复强烈的视网膜活动和行为仍然是某些疾病的挑战。一些研究显示，针对特定基因突变的rAAV递送策略能够有效治疗某些疾病，如视网膜营养不良GTP酶调节因子（RPGR）和IQ钙调素结合结构域蛋白1（NPHP5）缺乏。尽管如此，一些疾病可能需要更复杂的策略，如使用多个rDNA序列来恢复基因功能。此外，某些基因的多个转录亚型可能需要不同的递送策略来实现功能恢复。

#### 4.2 基因编辑

基因编辑策略直接在受影响的基因序列的原始位置进行修改。细菌CRISPR/Cas系统的重新利用使得基因治疗成为可能，这一技术能够重新编写几乎任何核苷酸序列。然而，由于可能的脱靶效应，基因编辑仍然面临挑战。因此，研究人员开发了基于CRISPR的策略，以减少突变风险并提高编辑精度。此外，研究人员还在探索基于rAAV的策略，以更有效地递送基因编辑工具，如使用双rAAV递送系统来递送不同的基因编辑组件。

#### 4.3 RNA编辑

RNA编辑是一种避免基因编辑潜在脱靶突变风险的治疗策略，通过RNA靶向机制来纠正IRDs相关的点突变。例如，使用腺苷脱氨酶（ADAR）在RNA中的作用，可以实现特定的A到G编辑。这种策略在肝细胞中已经得到证明，但在视网膜中仍需进一步研究。一些研究使用了截断的、无催化活性的Cas13（dPspCas13b (del)）与工程化的ADAR2DD-E488Q结合，以纠正ush2a基因的突变。

#### 4.4 表观遗传编辑

除了基因编辑，CRISPR/Cas系统还被用于表观遗传编辑。通过将催化失活的Cas（dCas）与染色质修饰酶（如组蛋白乙酰化酶或去乙酰化酶）结合，可以调控基因表达而不改变DNA序列。此外，一些研究还探索了使用dCas与转录调控因子（如VP64或KRAB）结合，以激活或抑制特定基因的表达。这种策略在治疗某些视网膜疾病方面展现出巨大潜力。

#### 4.5 RNA干扰和剪接调控

小干扰RNA（siRNA）和反义寡核苷酸（ASO）是用于抑制基因表达的常用工具，特别是在处理获得性功能突变时。通过RNA干扰（RNAi）途径，siRNA可以引导RNA诱导沉默复合物（RISC）降解互补的靶向mRNA，从而阻止其翻译为蛋白质。ASO则通过与靶向mRNA的互补碱基配对，引发mRNA降解或阻止翻译。一些研究表明，针对特定基因突变的ASO可以有效纠正剪接异常，如在CEP290相关的LCA中，使用ASO可以阻止伪外显子的插入。此外，一些研究还探索了使用rAAV递送ASO以调控剪接，这在视网膜疾病中可能具有重要应用。

#### 4.6 光遗传学治疗

光遗传学提供了一种基因无关的视觉恢复方法，通过将光敏感蛋白递送到内视网膜神经元（如双极细胞和RGCs），使它们能够作为人工光感受器发挥作用。最常见的是通过rAAV递送基因编码的光敏感蛋白，如Chrimson-TdTomato。尽管光遗传学可以恢复一些基本的视觉功能，但它可能带来更人工的视觉体验。因此，针对特定细胞类型的光遗传学策略需要优化以提高治疗效果并避免免疫反应。

### 5. 结论与未来方向

基于rAAV的基因治疗为IRDs的治疗提供了多种有前景的策略。随着衣壳工程和调控元件设计的进展，研究者能够更精确和高效地将基因传递到特定的视网膜细胞类型。此外，通过优化双向量策略和改进治疗技术，如基因和表观遗传编辑、RNA调控和光遗传学，rAAV介导的治疗潜力得到了进一步扩展。这些进展对于制定能够适应疾病异质性、不同发病时间和多样细胞退化模式的个性化治疗方案至关重要。未来的研究方向包括继续整合精确的向量设计与对疾病病理生理学的深入理解，以开发持久、安全且个性化的治疗方案，适用于广泛的IRDs。