新型肽类策略增强GBA1表达治疗帕金森病：基于水蛭源细胞穿膜肽的突破性发现

《npj Parkinson's Disease》：A novel peptide-based strategy to enhance GBA1 expression for treating Parkinson’s disease

　　本研究针对帕金森病中葡萄糖脑苷脂酶（GCase）活性降低这一关键病理环节，开发了GBA1-HiBiT基因敲入报告系统进行高通量筛选。研究人员从水蛭源肽库中鉴定出hirunipin 4（LP17）能显著增强GCase蛋白水平和酶活性，通过促进TFEB核转位和增加GCase蛋白稳定性，有效改善α-突触核蛋白（α-synuclein）预形成纤维（PFF）诱导的溶酶体功能障碍。该肽类药物为恢复PD患者溶酶体功能提供了新型治疗策略。

　　

在神经退行性疾病研究领域，帕金森病（Parkinson's disease, PD）作为第二大常见的神经退行性疾病，其病理特征表现为黑质多巴胺能神经元的选择性退化和α-突触核蛋白（α-synuclein）的异常聚集。近年来研究发现，溶酶体功能紊乱在PD发病机制中扮演着关键角色，其中葡萄糖脑苷脂酶（glucocerebrosidase, GCase）的编码基因GBA1被认为是PD最重要的遗传风险因素之一。

值得注意的是，GCase活性降低不仅存在于GBA1突变携带者，在散发性PD患者和正常老年人中也普遍存在。GCase与α-突触核蛋白之间形成恶性循环：GCase功能不足促进α-突触核蛋白聚集，而α-突触核蛋白的积累又进一步损害GCase的运输和功能。尽管科学家们已经尝试了酶替代疗法、化学伴侣疗法和基因治疗等多种策略，但由于血脑屏障穿透性、特异性或长期安全性等问题，目前尚未出现理想的治疗手段。

在这一背景下，细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides, CPPs）因其能够以受体非依赖方式跨过细胞膜，避免内体 sequestration，并特异性靶向溶酶体等细胞器，成为极具潜力的新型药物递送平台。本研究创新性地将HiBiT报告系统与肽类药物筛选相结合，为PD治疗提供了新思路。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了GBA1-HiBiT基因敲入HEK293T细胞系，建立了实时定量检测内源性GCase蛋白水平的发光报告系统；通过计算机辅助设计从水蛭基因组中筛选出18种候选细胞穿膜肽；使用α-突触核蛋白预形成纤维（preformed fibrils, PFF）诱导建立帕金森病细胞模型；采用免疫印迹、免疫荧光、溶酶体酶活性测定等技术评估肽类化合物的治疗效果；通过细胞核质分离和环己酰亚胺（cycloheximide, CHX）追踪实验探讨分子机制。

GBA1-HiBiT KI HEK293T细胞的构建与验证

研究团队首先通过CRISPR/Cas9介导的同源重组，将11个氨基酸的HiBiT标签插入到GBA1基因的C末端，在稳定表达LgBiT的HEK293T细胞中建立了GBA1-HiBiT基因敲入细胞系。

实验结果显示，TFEB过表达可显著提高GBA1-HiBiT KI细胞的生物发光信号，而Western blot分析进一步证实GCase蛋白水平相应增加，表明HiBiT标签不影响GBA1的正常表达和功能。

水蛭源细胞穿膜肽的筛选与鉴定

从水蛭基因组中筛选出的18种候选肽中，研究人员发现LP17、LP18和LP19能显著增强GCase蛋白表达。其中LP17（后命名为hirunipin 4）效果最为显著，在1μg/mL浓度处理24小时后，GCase蛋白水平明显上升。

Hirunipin 4改善病理学α-突触核蛋白聚集和神经毒性

在PFF处理的SH-SY5Y细胞和原代皮层神经元中，hirunipin 4能显著降低Ser129位点磷酸化α-突触核蛋白（pS129）水平，而不影响总α-突触核蛋白含量。特别值得注意的是，hirunipin 4将PFF诱导的细胞活力下降从50%改善至75%，并通过碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色验证了其神经保护作用。

Hirunipin 4增强溶酶体GCase活性并减少GlcCer积累

免疫荧光分析显示，hirunipin 4能恢复PFF诱导的GCase水平降低，并显著提高溶酶体GCase酶活性。同时，该肽能有效减少葡萄糖神经酰胺（glucosylceramide, GlcCer）的积累，这是GCase功能异常的直接下游效应。

Hirunipin 4促进TFEB核转位并增强GCase蛋白稳定性

机制研究表明，hirunipin 4能促进TFEB（转录因子EB）向细胞核转位，提高1.7倍的核TFEB信号，从而激活GBA1基因转录。同时，CHX追踪实验显示hirunipin 4能延长GCase蛋白半衰期，表明其还具有促进GCase蛋白稳定的作用。

本研究通过建立高效的GBA1-HiBiT报告系统，成功筛选出具有显著治疗潜力的水蛭源肽hirunipin 4。该肽通过双重机制——促进TFEB核转位激活转录和增强GCase蛋白稳定性，有效提高GCase水平和活性，进而改善溶酶体功能，减少α-突触核蛋白病理聚集，发挥神经保护作用。

这一发现不仅为帕金森病的治疗提供了新的候选药物，也展示了细胞穿膜肽在神经退行性疾病治疗中的巨大潜力。与传统的酶替代疗法和基因治疗相比，肽类药物具有可逆性、化学可调性和良好的血脑屏障穿透性等优势。此外，水蛭源肽的独特结构可能带来多功能的治疗效应，为开发针对溶酶体功能障碍的创新型治疗策略开辟了新途径。

尽管本研究目前仅限于体外实验，但研究结果为进一步的动物实验和临床前研究奠定了坚实基础。未来研究需要重点探讨hirunipin 4的体内药代动力学、血脑屏障穿透能力以及长期安全性，同时深入解析其与GCase调控通路相互作用的具体分子机制。这项发表在《npj Parkinson's Disease》的研究为帕金森病的精准治疗提供了新的思路和工具，具有重要的理论意义和临床应用价值。