活神经元中，富含脯氨酸区域的磷酸化状态对Tau蛋白与微管结合的调控机制

《Neuroscience Research》：Graded regulation of microtubule-binding of Tau by the phosphorylation state of the proline-rich region in living neurons

　　Tau蛋白磷酸化状态通过PRR2区域调控其与微管蛋白的动态结合，采用FRAP实验与Virtual Cell计算模型相结合的方法，揭示了非磷酸化位点数量而非具体位置对结合亲和力起主导作用。

　　Tau蛋白是一种与微管（MT）相关的蛋白，在维持神经元形态和轴突运输中发挥着关键作用。尽管已知磷酸化可以调节Tau与微管的相互作用，但其在体内特定磷酸化模式的贡献仍不明确，主要是因为细胞内的复杂环境使得这种调控难以直接观察。为此，本研究结合了荧光恢复后光漂白（FRAP）技术、去磷酸化模拟突变以及计算建模，分析了磷酸化对Tau与微管相互作用的影响。研究特别关注了富含脯氨酸的区域（PRR2），这一区域的磷酸化在生理和病理背景下均受到关注，并通过将关键磷酸化位点替换为丙氨酸（8A-Tau）来生成一个去磷酸化模拟的Tau突变体，然后将其与野生型Tau（WT-Tau）在FRAP实验中的微管结合动态进行比较。实验数据与基于模拟的参数探索相结合，揭示了非磷酸化位点的总体数量在调节Tau与微管亲和力方面的作用更为显著，而非这些位点的具体位置。这些发现为Tau的翻译后调控提供了新的视角，并建立了一个计算与实验相结合的框架，用于研究细胞内蛋白质的动态行为。

本研究首先探讨了Tau蛋白在神经元中的定位机制。在正常生理条件下，Tau蛋白主要定位于神经元的轴突，这已被高灵敏度检测方法进一步证实（Kubo et al., 2019a）。Tau通过促进微管稳定化，被认为参与了轴突生长、神经可塑性和货物运输等关键神经过程（Caceres and Kosik, 1990; Dawson et al., 2010; Dixit et al., 2008; Drubin et al., 1985; Ebneth et al., 1998; Esmaeli-Azad et al., 1994; Hirokawa et al., 1988; Kempf et al., 1996; Liu et al., 1999; Samsonov et al., 2004; Trinczek et al., 1999）。在一些神经退行性疾病——即tau蛋白病中，Tau蛋白会异常定位到细胞体和树突中，最终形成神经纤维缠结（Grundke-Iqbal et al., 1986; Kosik et al., 1986）。这种细胞内的“误定位”被认为是导致神经退行性和突触功能障碍的病理级联反应中的关键步骤（Hoover et al., 2010; Ittner et al., 2010; McInnes et al., 2018）。事实上，转基因小鼠模型的研究表明，过量表达的Tau会导致其在细胞体和树突中的异常分布，这是引发Tau病理发展的必要步骤（Kubo et al., 2019b）。因此，理解正常Tau如何定位于并维持在轴突中，以及这一机制为何在疾病中失效，是一个至关重要的挑战（Wang and Mandelkow, 2015）。

Tau蛋白的定位与其与微管的结合密切相关，而磷酸化被认为是调控这一过程的重要因素。高磷酸化的Tau蛋白在神经纤维缠结中大量存在，并且失去了与微管结合的能力。尽管一般认为Tau主要通过其C端的微管结合域（MTBD）与微管结合，但其他区域如PRR2也被证实参与了这一相互作用（Goode and Feinstein, 1994; Gustke et al., 1994）。最近，冷冻电子显微镜的结构分析提出了一个分子模型，其中Tau的微管结合区域沿着原纤维延伸，通过将微管二聚体连接在一起来稳定微管（Kellogg et al., 2018）。然而，这些结构模型提供了静态的结合图像，但如何在活细胞的复杂环境中动态调控这一相互作用仍不明确。一项最近的研究为这些区域在Tau正常轴突定位中的作用提供了新的视角（Iwata et al., 2019）。研究显示，通过MTBD的稳定结合并不对轴突定位至关重要，反而过度稳定的结合可能导致Tau的误定位。例如，一个缺乏MTBD的Tau突变体仍能正常定位到轴突，而一个在PRR2区域中模拟去磷酸化的突变体则表现出更强的微管结合能力，并被误定位到细胞体和树突中。这些发现强烈表明，除了MTBD之外，PRR2区域及其磷酸化状态对于调节Tau在神经元中的正常行为至关重要（Goode et al., 1997）。

尽管PRR2区域的重要性已被提出，但其磷酸化如何控制Tau与微管的结合动力学以及这种控制的具体量化程度仍不明确。一个主要问题在于难以在活神经元中了解并改变内源性Tau蛋白的磷酸化状态。因此，研究人员通过使用无电荷和负电荷氨基酸残基来模拟磷酸化和去磷酸化，对在体外表达的Tau进行相关突变。然而，仍然难以可靠地监测Tau的移动性和微管结合，并将其与诸如结合和解离速率等动力学参数联系起来。传统的生化方法和基于简单曲线拟合的FRAP分析在捕捉这种动态和定量调控的完整图景方面存在局限，因此需要更复杂的方法（Cowan and Loew, 2023）。

为了解决这些问题，本研究采用了一种综合方法，结合定量活细胞成像（FRAP）、定点突变和计算建模。我们系统分析了PRR2区域的磷酸化状态如何影响Tau在活神经元中的微管结合动力学。研究发现，PRR2区域的磷酸化状态能够以梯度方式调节其与微管的亲和力。此外，开发的计算模型使我们能够估算该调控背后的动力学参数，从而更深入地理解Tau的功能调控。

为了验证这些发现，我们使用了多种突变体进行实验分析。例如，我们发现模拟去磷酸化的8A-Tau突变体表现出显著降低的FRAP恢复速率，而模拟磷酸化的8E-Tau突变体则显示出更快的恢复，这与它们更短暂、弱结合的状态一致（Iwata et al., 2019; Rodríguez-Martín et al., 2013）。同时，我们还观察到，其他单一的去磷酸化突变体（如198A和199A）在某些情况下也表现出显著的恢复速率下降，而其他单一突变则没有明显差异。这表明，PRR2区域中非磷酸化残基的总体数量比特定位点的磷酸化状态对Tau与微管的结合动力学影响更大。我们还发现，8A-Tau的恢复速率显著降低，而与之相比，8E-Tau的恢复速率显著增加，这一现象在使用Tau-KO神经元进行实验时也得到了验证，表明这种动力学变化并非由于过表达导致的聚集，而是由于Tau与微管之间的强相互作用。

为了进一步探讨这些机制，我们使用了虚拟细胞（Virtual Cell）平台构建了一个计算模型，以模拟Tau与微管的相互作用。我们基于实验数据和文献资料，设定了初始蛋白浓度、扩散系数和几何结构等参数。通过比较模拟曲线与实验数据，我们估算出Tau的解离常数（Kd）为3 μM，这一值与文献中报道的Kd范围（约0.01 μM至2 μM）一致，但因实验条件和方法的不同而有所变化。我们还发现，8A-Tau的Kd值显著降低，表明其与微管的结合能力增强。这一结果支持了这样一个观点：在发育中的神经元中，Tau在PRR2区域的高度磷酸化可能是其正常功能的关键。

我们的研究还揭示了PRR2区域的磷酸化状态能够独立于MTBD调节Tau与微管的结合。通过分析8A-delMTBD突变体，我们发现即使在缺乏MTBD的情况下，PRR2区域的磷酸化状态仍然能够改变Tau对微管的亲和力。这一结果与冷冻电子显微镜（CryoEM）分析中未观察到明显的PRR2-微管相互作用似乎存在矛盾，但我们的实验和之前的研究表明，PRR2区域确实参与了微管结合。此外，最近的一项体外研究显示，PRR2区域本身能够与微管结合，而其磷酸化则会减弱这种结合（Acosta et al., 2025）。因此，我们的研究结果与现有文献一致，支持了一种更复杂的模型，其中MTBD作为主要的“锚定”区域，而PRR2区域则作为一个调节器，动态调节Tau与微管之间的相互作用强度。

尽管本研究提供了关于PRR2区域磷酸化对Tau-微管相互作用的影响的新见解，但仍有一些局限性需要指出。由于我们使用了丙氨酸替换作为模拟去磷酸化的手段，因此无法排除这些突变对微管结合的结构或其他非特异性影响。虽然我们之前观察到模拟磷酸化突变（如谷氨酸替换）对微管结合的影响与模拟去磷酸化突变相反，但这一结果仍需进一步验证。此外，由于8E-Tau的效应较小，难以在当前的动态范围内检测到足够的差异，因此本研究选择了8A-Tau作为主要分析对象。在未来的实验中，使用更成熟的神经元可能会提供更宽泛的FRAP变化范围，从而更准确地评估模拟磷酸化突变的影响。另外，我们依赖于内源性蛋白对未改变残基的磷酸化能力来提取模拟去磷酸化对PRR2区域的影响。在体外结合实验中，8A-Tau与WT-Tau在电荷上是相同的，因此难以区分。然而，在发育中的神经元中，Tau可以被高度磷酸化，因此我们能够检测到这些突变的影响。

最后，本研究的局限性还包括使用FRAP数据进行模拟时的分辨率问题。由于FRAP实验的时间分辨率有限，我们无法精确测定结合反应的速度。此外，尽管模型比较表明8A-Tau的结果更适合由至少两个不同结合池组成的模型，但我们无法确定这些池的具体含义，以及是否仅需要两个池即可准确描述这一现象。至少，这一发现与观察到的个体FRAP曲线的异质性一致，这可能反映了Tau在活神经元中磷酸化状态的异质性。最后，我们没有在模型中纳入微管的纤维状特性，这可能对Tau的结合动力学产生重要影响，因为微管的纤维结构可能增加Tau结合位点的局部浓度，并促进其重新结合。因此，未来的研究应考虑引入微管的纤维状特性，以获得更准确的Tau结合模型。