探索辛可宁与人转铁蛋白的结合机制：实验与计算相结合的方法及其在神经退行性疾病治疗中的潜力

《Scientific Reports》：Exploring the binding of cinchonine with human transferrin: combined experimental and computational approaches

　　本研究针对神经退行性疾病治疗药物开发难题，首次采用多学科方法探索天然生物碱辛可宁(cinchonine)与人转铁蛋白(hTf)的相互作用机制。通过紫外-可见光谱、荧光猝灭实验证实两者形成稳定复合物（结合常数K分别为0.7×106 M-1和0.14×106 M-1），分子动力学模拟揭示辛可宁通过与Thr392形成氢键稳定结合于hTf空腔。该发现为开发基于hTf靶点的神经保护疗法提供了新思路，发表于《Scientific Reports》彰显其转化价值。

　　

随着全球人口老龄化趋势加剧，神经退行性疾病（Neurodegenerative Diseases, NDs）已成为威胁公共健康的重大挑战。这类疾病以神经元进行性、不可逆性丧失为特征，其中阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）作为最常见类型，占痴呆病例的70%以上。当前治疗手段面临诸多瓶颈：血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）穿透效率低、诊断滞后导致错过最佳干预窗口、以及现有药物存在局限性副作用。尽管Lecanemab和Aducanumab等药物陆续问世，研发更安全有效的治疗策略仍是当务之急。

在这一背景下，天然产物因其多靶点作用和较低毒性受到广泛关注。辛可宁（cinchonine）作为金鸡纳树皮提取的天然生物碱，已被报道具有抗氧化、抗炎、乙酰胆碱酯酶抑制和β-淀粉样蛋白（Amyloid-β）抑制等多重药理活性。尤为重要的是，其分子量小于500 Da且符合类药五规则（Lipinski's Rule of Five），预示其具备良好的血脑屏障穿透能力。然而，该化合物与神经保护相关蛋白的相互作用机制尚不明确。

人转铁蛋白（human Transferrin, hTf）作为铁代谢关键糖蛋白，近年来被发现在神经退行性疾病中扮演重要角色。它通过调节脑内铁稳态，间接影响氧化应激、蛋白质错误折叠等病理过程。研究表明，hTf的铁螯合作用可减少β-淀粉样蛋白聚集，其自身亦具备直接神经保护功能。因此，探究小分子化合物与hTf的相互作用，对开发神经退行性疾病治疗新策略具有重要科学意义。

本研究首次采用实验与计算生物学相结合的策略，系统揭示辛可宁与hTf的分子结合机制。通过紫外-可见光谱（UV-Vis Spectroscopy）和荧光猝灭实验（Fluorescence Quenching Assay）证实二者可形成稳定复合物；借助分子对接（Molecular Docking）精准定位结合位点；结合200纳秒分子动力学模拟（Molecular Dynamics Simulations）与MM-PBSA（Molecular Mechanics Poisson-Boltzmann Surface Area）自由能计算，从原子层面阐释结合过程的动态稳定性与能量特征。

关键技术方法包括：紫外-可见光谱法测定蛋白-配体复合物形成；荧光猝灭实验计算结合常数；分子对接预测结合位点；分子动力学模拟分析复合物稳定性；MM-PBSA方法量化结合自由能。所有计算基于人转铁蛋白晶体结构（PDB ID: 3V83）和辛可宁的优化三维结构（PubChem ID: 90454）开展。

紫外-可见光谱分析

通过滴定hTf与浓度梯度增加的辛可宁（0-0.9 μM），观察到279 nm处吸收峰出现高色效应（hyperchromic effect），表明辛可宁与hTf发生相互作用。基于修正的比尔-朗伯定律（Modified Beer-Lambert's equation）计算得出结合常数K为0.7×10⁶ M^-1，证明二者可形成稳定复合物。

荧光结合实验

利用hTf内源荧光团（主要是色氨酸）与辛可宁结合后的荧光强度变化，通过Stern-Volmer方程求得猝灭常数K_sv为3.19×10⁶ M^-1，修正Stern-Volmer方程计算结合常数K为0.14×10⁶ M^-1，进一步验证复合物稳定性。

分子对接

对接结果显示辛可宁以-6.9 kcal/mol的结合亲和力嵌入hTf深部空腔，与Thr392形成关键氢键，同时存在π-阴离子、烷基和范德华力等多种相互作用。与hTf共结晶配体8R6（-5.2 kcal/mol）相比，辛可宁表现出更优结合特性。

分子动力学模拟

200 ns模拟显示复合物体系均方根偏差（Root Mean Square Deviation, RMSD）在50 ns后趋于稳定（2.95-3.05 nm），均方根涨落（Root Mean Square Fluctuation, RMSF）分析表明辛可宁结合可降低蛋白质残基波动。回转半径（Radius of Gyration, Rg）和溶剂可及表面积（Solvent Accessible Surface Area, SASA）结果证实复合物结构紧凑性未受显著影响。

氢键动力学与自由能景观

氢键分析显示辛可宁与hTf间维持1-3个稳定氢键。主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）表明结合后蛋白质构象空间受限，自由能景观（Free Energy Landscape, FEL）显示复合物能量洼深度差（1.1 kcal/mol）小于游离hTf（2.4 kcal/mol），提示结合态构象更均一稳定。

MM-PBSA结合自由能计算

MM-PBSA分析得出辛可宁与hTf的结合自由能（ΔG_binding）为-14.82±3.18 kJ/mol，其中范德华力和静电相互作用为主要驱动力，证实结合过程的热力学自发性。该结果与实验测得的结合常数高度一致。

本研究通过多维度证据链证实辛可宁与hTf可形成高亲和力稳定复合物。实验方面，光谱学数据给出定量的结合常数；计算模拟则从原子分辨率揭示结合位点、动态演变过程及能量学特征。尤为重要的是，辛可宁结合不仅未破坏hTf结构完整性，反而通过稳定其铰链区可能增强铁结合功能，这为缓解神经退行性疾病中的铁稳态失衡提供了新机制。尽管该研究缺乏体内实验验证，但其整合多学科技术的策略为天然产物靶向蛋白相互作用研究树立了范式。未来需在细胞和动物模型中进一步验证辛可宁通过hTf介导的神经保护效应，推动其向临床治疗应用转化。