NFI-X转录因子DNA识别的结构基础：揭示NFI家族原型的“罗塞塔石碑”

《Nature Communications》：Structural basis of Nuclear Factor 1-X DNA recognition provides prototypic insight into the NFI family

　　本研究针对核因子I（NFI）家族转录因子DNA识别机制不明的难题，通过X射线晶体学和冷冻电镜解析了NFI-X DNA结合域（DBD）及其与DNA复合物的高分辨率结构。研究揭示了NFI-X DBD具有类似Smad MH1结构域的新型折叠，发现了关键的Zn2+结合位点和C末端螺旋交换二聚化机制，阐明了其识别回文序列TTGGC(N5)GCCAA的结构基础。该结构作为NFI家族的“罗塞塔石碑”，为理解其在发育、癌症和先天性疾病中的作用提供了精确的结构模板。

　　

在细胞生物学领域，核因子I（Nuclear Factor I，NFI）家族转录因子一直是个令人着迷又充满谜团的存在。这些蛋白质不仅参与腺病毒DNA复制，还调控基因转录、干细胞增殖和分化，在发育、癌症和先天性疾病中扮演关键角色。然而，尽管NFI家族被发现已有数十年，其分子作用机制却始终笼罩在神秘面纱之下，主要原因是难以获得足够量的重组蛋白进行体外结构表征。

NFI家族包括四个成员：NFI-A、NFI-B、NFI-C和NFI-X。其中，NFI-X尤其引人关注，因为它在神经干细胞生物学、造血功能、肌肉发育、肌营养不良和肿瘤发生中起着至关重要的作用。NFI-X在整个大脑中表达，参与胚胎发生过程中的神经系统发育和神经元干细胞稳态维持。在肌肉中，NFI-X通过调节胎儿特异性肌生成程序和纤维类型特性，在骨骼肌发育中发挥关键作用。

尽管科学家们已经知道NFI以二聚体形式结合到双链DNA的回文共识序列TTGGC(N₅)GCCAA上，具有纳摩尔级的亲和力，但精确的分子机制却一直是争论的焦点。NFI DNA结合域（DNA-binding domain，DBD）在家族成员间具有高达85%的序列同一性，这一高度保守性暗示可能存在共同的结构基础。然而，由于NFI与其他已知结构的转录因子序列同源性很低，使得结构解析工作充满挑战。

为了揭开NFI-X的分子神秘面纱，研究人员设计了两组重组蛋白构建体：NFI-X¹⁷⁶（残基14-176）代表最小预测DBD，而NFI-X¹⁹³包含了额外的17个C末端残基。实验表明，较长的构建体具有更高的DNA结合亲和力，表观解离常数（K_d）为48.1±0.49 nM。这种差异提示C末端区域对NFI-X DBD的高亲和力DNA结合至关重要。

研究人员主要运用了X射线晶体学和冷冻电镜技术解析结构，通过电泳迁移率变动分析（EMSA）验证DNA结合特性，利用圆二色谱（CD）分析蛋白稳定性，并通过火焰原子吸收光谱（FAAS）检测锌离子存在。其中，NFI-X¹⁷⁶的晶体结构通过单波长反常散射（SAD）法解析至2.7?分辨率，而NFI-X¹⁹³/DNA复合物结构则通过冷冻电镜解析至3.86?分辨率。

NFI-X DBD在溶液中为单体

生物信息学分析指导设计了两组蛋白构建体。尺寸排阻色谱（SEC）和SDS-PAGE显示两种构建体在溶液中均为单体，热变性曲线显示它们具有相似的熔解温度（Tm），分别为55.6°C和56.2°C，表明构建体稳定性良好。

NFI-X DBD的C末端增加DNA结合亲和力

EMSA实验显示，NFI-X¹⁹³比NFI-X¹⁷⁶具有更高的DNA结合亲和力。竞争性EMSA证明结合具有序列特异性，且NFI-X以二聚体形式结合DNA。当间隔区缩短至4bp时，二聚体形成受阻，仅能观察到单体结合。

NFI-X DBD具有MHI样折叠并包含保守的Zn²⁺结合位点

NFI-X¹⁷⁶的晶体结构揭示其折叠可细分为两个结构域："天线"结构域和"核心"结构域。核心结构域与Smad转录因子的MH1结构域是同源结构，尽管序列同一性低（<20%）。关键发现是一个Zn²⁺离子与保守的CCCH基序（Cys103、Cys156、Cys162和His167）配位，这一结构特征对DBD的正确折叠和稳定至关重要。

NFI-X DBD以二聚体形式结合DNA大沟，通过C末端交换机制稳定

冷冻电镜结构直接展示了NFI-X二聚体与DNA结合的模式。二聚化通过C末端螺旋（α5）的交换机制实现：一个亚基的C末端螺旋被夹在另一个亚基的相同螺旋和环140-143之间。这种交换机制解释了为什么缺失C末端的NFI-X¹⁷⁶构建体DNA结合亲和力降低。

天线结构域和β-发夹环是NFI-X DNA结合的结构决定因素

每个NFI-X¹⁹³原体以类似方式与每个半位点相互作用，天线和核心结构域在DNA螺旋的相对两侧。序列特异性相互作用仅由两个残基提供：Arg116和Lys125，它们接触每个半位点的三个G碱基。

研究发现，未结合状态下，β-发夹环和天线结构域通过Asp124和Arg38侧链间的盐桥锁定在一起。DNA结合后，Arg38侧链改变方向，与DNA磷酸基团形成盐桥，从而解锁β-发夹环，使Lys125侧链能够移入大沟提供序列特异性DNA结合相互作用。

Malan综合征突变体的功能影响

研究还分析了与Malan综合征（一种以过度身体生长、骨骼异常和智力障碍为特征的罕见遗传病）相关的八个突变。EMSA显示，大多数β-发夹中的病理突变（Lys113Glu、Arg115Trp、Arg116Gln、Arg116Pro、Lys125Glu）完全丧失DNA结合活性，而Arg128Gln部分丧失活性，Arg121Pro突变体则保持与野生型相似的DNA结合能力。

本研究首次揭示了NFI转录因子的DNA识别机制，解决了该领域长期存在的关键问题。NFI-X DBD具有特殊的折叠方式，以四螺旋束核心结构域为基础，让人联想到Smad MH1结构域，并具有一个α-环-α天线结构域，这是NFI特有的N末端DBD插入。核心结构域代表一个稳定的分子平台，天线结构域和β-发夹区域从中突出，形成带正电荷的裂隙用于DNA结合。

Zn²⁺结合位点通过保守的CCCH基序在NFI家族中保持稳定，该离子发挥结构稳定作用。其从NFI-X¹⁹³中螯合去除会导致蛋白不稳定和沉淀，这解释了早期研究发现三个Cys配位残基对DNA结合至关重要的生化数据。

NFI-X以二聚体形式结合NFI共识序列，每个亚基将其β-发夹从DNA的同一侧插入大沟。NFI-X DBD在溶液中为单体，仅在DNA结合时通过C末端螺旋α5的交换机制二聚化。移除该螺旋会降低DNA结合亲和力，因此螺旋α5是NFI在DNA上二聚化所必需，但不足以在溶液中二聚化。

DNA识别模式基于每个蛋白亚基二聚体的β-发夹环插入位于DNA大沟中的回文NFI位点的半位点。碱基读取相互作用仅涉及两个NFI-X残基（Arg116和Lys125），它们接触每个半位点的三个G碱基，合理化了对这些碱基作为调节DNA结合亲和力最相关的DNA共识序列突变。

特别有趣的是，天线结构域残基Arg38触发了一个构象变化，需要将β-发夹环插入DNA的大沟。在未结合的NFI-X中，该残基参与与Asp124的分子内盐桥，在DNA结合状态下被磷酸基团取代。这种在Arg38的转换似乎是β-发夹环插入DNA大沟所必需和充分的，并允许Lys125侧链重新定位到大沟中，与Arg116一起读取DNA共识基序。

二聚体架构为NFI结合位点中5bp间隔区的强烈偏好提供了结构解释。4bp的间隔区会在原体之间产生空间位阻，只有单个单体能够结合到单个半位点。相反，长于5bp的间隔区会使C末端DBD螺旋彼此距离过远，防止二聚化从而降低DNA结合亲和力。

冷冻电镜结构中存在的超螺旋结构提出了NFI转录因子通过蛋白质-蛋白质相互作用介导DNA环化的可能性。尽管尚未在细胞环境中报道这种超复合物的存在，但冷冻电镜纤维中确定的蛋白质-蛋白质相互作用热点与 proposed 涉及NFI介导的病毒DNA复制激活的区域（α3）重合，通过NFI与病毒预起始DNA聚合酶复合物的直接相互作用。在NFI-X¹⁹³/DNA复合物中，该区域是溶剂可及的，并且不被结合DNA的存在所阻断，这为支持NFI作为DNA聚合酶复合物招募者在复制起点结合后的作用提供了结构证据。

总之，该研究代表了一块"罗塞塔石碑"，不仅结构上解码了大量关于NFI蛋白的生化和功能数据，而且为分析NFI的其他功能作用和合理设计调节这类转录因子DNA结合特性的化合物提供了基础，在NFI-X的情况下可能应用于肌营养不良治疗，以及与其他NFI相关的病理如癌症、神经发育障碍等。该研究发表于《Nature Communications》杂志，为理解转录因子DNA识别机制提供了重要突破，为未来针对NFI相关疾病的治疗策略开发奠定了坚实基础。