海胆幼虫非视觉光感受性脑区的发现及其在后口动物脑进化中的意义

《Nature Communications》：Non-visual photoreceptive brain specification in sea urchin larvae

　　本研究针对后口动物中枢神经系统起源这一关键进化问题，以海胆幼虫为模型，通过单细胞RNA测序等技术，鉴定出一个表达Opsin5的非视觉光感受性神经元簇。该区域表达rx、otx、six3等保守基因，与脊椎动物间脑同源；功能实验表明Opn5L介导光依赖性游泳行为，揭示了后口动物祖先已具备脑相关功能的分子基础，为理解脑的早期进化提供了重要证据。

　　

在动物王国中，复杂的大脑是脊椎动物和某些无脊椎动物（如章鱼和昆虫）能够感知环境、协调行为并适应复杂生存挑战的关键。然而，这个精妙的指挥中心是如何在漫长的进化历程中产生的，仍然是生物学领域一个悬而未决的谜题。特别是在后口动物（包括我们人类所在的脊索动物、以及海胆、海星等棘皮动物和半索动物）这一大类群中，大脑的起源显得尤为模糊。传统观点认为，棘皮动物（例如海胆）缺乏类似大脑的集中化神经系统，尤其是在其自由游动的幼虫阶段。然而，近年来的基因表达和神经活动研究逐渐揭示，海胆幼虫的神经系统可能拥有一些类似大脑的特性，只是这些特性与行为之间的直接联系仍有待阐明。

为了探索后口动物大脑的进化源头，研究人员将目光投向了海胆幼虫——这类在神经生物学研究中被广泛使用的棘皮动物/步带动物模型。尽管它们身体结构简单，但其前部神经外胚层衍生的神经系统被认为是研究脑相关结构起源的理想系统。本研究旨在回答一个核心问题：在缺乏典型大脑结构的海胆幼虫中，是否存在一个功能性的、能够整合环境信息（特别是光信号）并调控行为的“脑样”区域？如果存在，它的分子特征是否与更高等的后口动物（如脊椎动物）的大脑区域有共通之处，从而为大脑的同源进化提供证据？

为了解决这些问题，一个研究团队对一种名为Hemicentrotus pulcherrimus的海胆幼虫进行了深入探究。他们发现，在海胆幼虫的后部神经外胚层存在一个对光敏感的神经元簇。这些神经元表达一种对紫外线敏感的非视觉视蛋白——Opsin5（文中具体基因为Opn5L），同时表达一系列在脊椎动物间脑（ forebrain/pre-oral brain）发育中至关重要的调控基因，如rx、otx、six3和lhx6（awh）等。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和原位杂交技术，研究人员精确绘制了这一脑样区域的细胞组成和空间分布。他们发现，这些Opsin5L阳性的神经元是一群独特的背侧血清素能神经元，与之前已知的前部血清素能神经元在基因表达和空间位置上均不相同。功能丧失实验（通过吗啉代反义寡核苷酸敲低Opn5L）表明，缺失Opn5L会损害幼虫的光依赖性游泳行为，证明这些神经元在光感受中扮演着主动角色。更有趣的是，这些背侧光感受神经元表现出迁移能力，它们从最初的背侧位置向靠近前部神经元的方向移动，这一过程可能由转录因子Snail（sna）介导，类似于脊椎动物神经系统发育中的细胞迁移事件。

这项研究发表在《Nature Communications》杂志上，其意义在于首次在棘皮动物幼虫中明确界定了一个具有非视觉光感受功能的脑样区域，该区域在分子水平上与脊椎动物的前脑/间脑区域显示出深刻的相似性。这不仅强有力地支持了“后口动物共同祖先已经拥有某种形式的大脑原基”的假说，也将大脑相关结构的进化史向前推移到了约5亿多年前。海胆幼虫为我们提供了一个独特的视角，来观察在缺乏复杂视觉器官的情况下，非视觉光感受系统如何独立地演化并协调基本行为，这对于理解神经系统功能的早期进化至关重要。

为开展此项研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：首先，利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，并结合γ-分泌酶抑制剂DAPT处理以富集神经元群体，系统分析了海胆幼虫神经发生过程中的细胞异质性和基因表达谱，从而识别出背侧血清素能神经元这一独特亚群。其次，通过全胚胎原位杂交和免疫组织化学技术，在整体水平上验证和定位了关键基因（如opn5L、z167、tph等）和蛋白（如血清素、Synaptotagmin B）的表达模式。第三，应用吗啉代反义寡核苷酸（MO）基因敲降技术，在活体胚胎中研究Z167、Opn5L和Snail等基因的功能。第四，利用活体成像技术（通过注射z167顺式调控元件驱动的Venus荧光蛋白报告基因构建体），实时观察了背侧血清素能神经元的迁移动态。最后，通过体外生化实验（蛋白质纯化、光谱分析和基于水母素的钙离子信号检测）表征了海胆Opn5L蛋白的光感受特性和信号转导能力。研究所用海胆样本采集自日本多地海岸。

研究结果

单细胞RNA-seq揭示了海胆幼虫前神经外胚层区域存在非视觉光感受神经元

为了深入研究海胆幼虫前神经外胚层衍生的神经系统，研究人员对Hemicentrotus pulcherrimus从囊胚期到幼体期的多个时间点进行了单细胞RNA测序。为了克服幼虫阶段特定神经元（如血清素能神经元）数量极少的挑战，他们采用了DAPT（一种γ-分泌酶抑制剂）处理策略，通过抑制Notch信号通路来增加神经元分化的数量，从而更清晰地解析神经细胞群体。分析发现，表达色氨酸羟化酶（tph，血清素合成的限速酶）的血清素能神经元清晰地分为两个簇。其中一个簇特异性地表达非视觉视蛋白基因opn5L。通过原位杂交证实，opn5L的表达从早期广泛分布逐渐限制到几个细胞，并在36小时的棱柱幼虫期与foxQ2（前神经外胚层的初始决定因子）表达域背侧的神经元共定位。这表明存在一个此前未知的、区别于前部血清素能神经元的背侧血清素能神经元群体。

空间分布分析揭示了血清素能神经元在发育过程中的动态变化。在36小时，血清素能神经元呈单排在前部排列。到42小时（幼体期），背侧血清素能神经元出现，并似乎向前部神经元迁移，在54小时时与之相邻。前部神经元呈沿前后轴伸长的形态，而背侧神经元保持球形。这些独特的形态持续到72小时。这些发现揭示了幼体幼虫中存在两种血清素能神经元群体：伸长的前部神经元和表达opn5L的背侧神经元。

Opn5L细胞表达与其他生物神经外胚层和大脑发育相关的基因

基于单细胞RNA测序数据，研究人员比较了两个tph表达簇（背侧和前部血清素能神经元）的基因表达谱。他们筛选出在背侧opn5L阳性簇中高表达的、可能与神经发生或神经元功能相关的基因（如转录因子、信号分子、膜蛋白），并通过原位杂交验证了它们的表达模式。

研究发现，z167基因特异性地在背侧血清素能神经元中表达，而不在前部神经元中表达。相反，ebf3则特异性地表达于前部血清素能神经元。双色原位杂交显示z167和ebf3的表达在空间上是相互排斥的。吗啉代敲降实验表明，Z167对于背侧血清素能神经元的血清素合成至关重要，但前部神经元基本不受影响，且背侧域的神经元分化本身（由泛神经元标记SynB指示）并未被破坏。

此外，与细胞迁移相关的snail（sna）、与颅神经节发育相关的hmx、以及six3、limc1（lhx2/9）、awh（lhx6）、otx、cryptochrome-1（cry1）和rx等多个在神经发育中重要的基因，均在背侧血清素能神经元区域或其相关区域有表达。许多基因在正常幼虫中因表达量低难以检测，但在DAPT处理后的胚胎中变得清晰可见。

背侧光感受器/血清素能神经元通过迁移形成完整的神经系统

背侧血清素能神经元表达转录抑制因子sna，该因子在脊椎动物的迁移性神经嵴细胞和海胆的迁移性中胚层细胞中起关键作用。为了研究其迁移行为，研究人员将z167顺式调控元件控制下的Venus荧光蛋白DNA构建体显微注射到海胆卵中。活体成像显示，位于背侧外胚层的背侧血清素能神经元在数小时内迁移至细胞密度较高的、包含前部血清素能神经元的区域。通过测量前部和背侧血清素能神经元之间的距离，证实了这种靠近的趋势。详细的光学切片显示，迁移的背侧血清素能神经元从上皮层脱离（分层）进入囊胚腔。Sna敲降会导致背侧血清素能神经元数量减少或在72小时时无法检测到，但由于早期发育受到干扰，无法直接评估Sna在神经元迁移中的作用。这些数据表明海胆神经元具有迁移行为，这可能是后口动物共有的特征。

Opn5L为海胆幼虫游泳行为所必需

海胆幼虫的背侧光感受神经元与脊椎动物间脑有相似之处，特别是都表达Opsin5。为了探究其功能，研究人员使用吗啉代敲低了Opn5L，这并不影响幼体幼虫的生长、形态以及前后血清素能神经元的发育模式。他们观察了幼虫在光照下的行为。连续白光照射会抑制对照幼虫的漂浮/游泳行为，大约70%的对照幼虫在连续光照三天后沉降至培养皿底部，而Opn5L敲降幼虫则保持了漂浮行为。使用第二个非重叠吗啉代也得到了类似结果。体外光反应实验证实海胆Opn5L是一种紫外敏感的、双稳态的视蛋白，光照能触发细胞内钙离子信号升高。这表明Opn5L通过感知光（可能对白光中的紫/蓝光成分有反应）来调节幼虫的游泳行为，可能是一种避免长时间（尤其是紫外线）暴露的机制。

结论与讨论

本研究在海胆幼虫中鉴定出一个非视觉光感受性的脑样区域，该区域在基因表达谱上与脊椎动物前脑具有显著的相似性，特别是rx、otx、nkx2.1、awh（lhx6）等区域特异性转录因子的保守性。功能实验证明该区域通过Opn5L介导光感受并调节幼虫行为。这些发现表明，后口动物共同祖先可能已经具备了形成具有类似大脑功能区域的遗传蓝图。

尽管棘皮动物没有发展出像脊索动物那样内部化、模块化的大脑结构（如下丘脑、垂体），但其幼虫保留了外部的光感受神经元以适应其浮游生活的生态需求。这种差异反映了共享的发育潜能与谱系特异性限制之间的适应性平衡。海胆幼虫中有限的神经元分层内化以及成体神经系统在内骨骼中的内部化，都暗示神经内部化的机制可能存在于祖先后口动物中，并在不同谱系中被加以改造利用。

研究发现的表达Opsin5的迁移神经元及其在光敏感行为中的作用，强调了后口动物神经系统背后共同的遗传和发育框架。特别是，Opsin5在调节光反应行为方面的保守性提示其可能具有古老的进化起源。海胆由于缺乏眼状视觉系统，为研究非视觉视蛋白的起源和功能提供了一个独特的模型，有助于理解这些分子如何贡献于光感知和环境适应。

总之，这项研究将海胆定位为一个重要的模型，用于理解神经和大脑进化中的共享方面和谱系特异性方面，以及后口动物中非视觉视蛋白的进化和功能多样化。它为解决后口动物中枢神经系统起源这一长期问题提供了关键证据，揭示了大脑相关结构的深层进化根源。