调控生物分子凝聚相界面蛋白吸附行为以抑制α-突触核蛋白聚集的新策略

《Nature Communications》：Controlling interfacial protein adsorption, desorption and aggregation in biomolecular condensates

　　本研究针对淀粉样蛋白在生物分子凝聚相界面异常聚集加速神经退行性疾病进程的关键问题，通过系统分析α-突触核蛋白（αSyn）在肽基异型凝聚相界面的吸附动力学机制，发现其遵循弗伦德里希型多层吸附等温线规律。研究团队创新性地提出通过调节凝聚相ζ-电位、竞争性蛋白吸附和膜界面优先结合三种生物相关性策略，可有效逆转αSyn界面富集并显著延缓其纤维化聚集进程，为相关疾病干预提供了新思路。

　　

在细胞复杂的内部环境中，生物分子凝聚相（biomolecular condensates）通过液-液相分离（liquid-liquid phase separation, LLPS）形成无膜细胞器，这些动态结构在调控细胞功能中发挥着关键作用。然而近年研究发现，诸如α-突触核蛋白（α-synuclein, αSyn）等与帕金森病相关的淀粉样蛋白，会特异性地富集在凝聚相界面，引发异质成核（heterogeneous nucleation）并显著加速蛋白纤维化聚集进程。这一现象为理解神经退行性疾病的发病机制提供了新视角，但界面富集的具体分子机制及相应的调控策略仍不明确。

荷兰拉德堡德大学Evan Spruijt团队在《Nature Communications》发表的研究中，利用聚-D,L-赖氨酸/聚-D,L-谷氨酸（pLys/pGlu）这一可精确调控ζ-电位的模型凝聚相系统，深入探究了αSyn在界面处的吸附行为机制。研究发现αSyn的界面定位由其凝聚相两亲性（condensate-amphiphilic nature）和界面电荷共同决定：带负电的αSyn（pI=4.67）通过静电作用吸附于带正电的凝聚相界面（ζ-电位=+8.1 mV），而截短变体αSyn(1-108)（带正电）和αSyn(60-140)（缺乏正电N端）则分别被排斥至稀相或分配至凝聚相内部。

通过微电泳（microelectrophoresis）和荧光定量分析，团队首次发现αSyn的界面吸附符合弗伦德里希等温线（Freundlich isotherm），表明凝聚相界面存在异质性多层结合位点，最大吸附容量（S_sat）约为84 μM。当NaCl浓度超过250 mM时，静电作用被完全屏蔽，αSyn界面吸附被彻底抑制。类似现象也在TDP-43-TEV-mCherry中观察到，说明电荷斑块介导的界面吸附具有普适性。

基于上述机制，研究提出了三种逆转αSyn界面富集的生物学策略：（1）添加可调节ζ-电位的生物分子（如NTPs、RNA寡核苷酸），5 mM ATP可使凝聚相ζ-电位由正转负（-3.0 mV），实现αSyn的可逆解离；（2）引入竞争性界面吸附蛋白（如G3BP1、DDX4-YFP、EGFP-NPM1、Hsp70、Hsc70），其中EGFP-NPM1可通过形成多相凝聚相（multiphase condensates）有效隔离αSyn；（3）利用膜界面优先吸附特性，当DOPG/DOPC脂质体（liposomes）进入凝聚相时，αSyn随之共分配至相内部。

关键实验技术包括：单液滴ζ-电位微电泳测定、光镊融合实验（optical-trap fusion）表征界面张力、活性流变学（active rheology）分析粘度、光栅图像相关光谱（Raster Image Correlation Spectroscopy, RICS）检测蛋白扩散、硫黄素T（Thioflavin T, ThT）荧光法追踪聚集动力学、双标记分子内FRET探针构象变化以及核磁共振（NMR）定量代谢物分配系数。

aSyn定位受ζ-电位和蛋白两亲性调控

研究通过系统改变pLys/pGlu混合比例（1:2至1.6:1），证实αSyn界面吸附量随ζ-电位升高而增加并最终达到平台。Freundlich模型拟合显示，结合强度参数n值从低盐条件下的1.86降至高盐时的1.15，说明静电作用是主要驱动力。FRET实验进一步揭示界面处的αSyn构象更为紧凑，为其加速成核提供了结构基础。

NTPs与寡核苷酸可调控凝聚相ζ-电位并移除αSyn

生理浓度ATP（0.5-5 mM）及GTP/CTP/UTP均可有效逆转界面电荷，使αSyn界面分配系数（K_P）降低约3倍。短链RNA（A₁₅/C₁₅/U₁₅）凭借多价性在0.1 mM即可实现类似效果，且该过程完全可逆。值得注意的是，ATP对αSyn(60-140)的相分配无显著影响，印证了其作用靶点为界面而非相内部。

蛋白质通过竞争性吸附置换αSyn

Hsp70/Hsc70等分子伴侣虽未完全取代αSyn，但通过界面共定位可能增强其 chaperone 功能；而EGFP-NPM1、DDX4-YFP等则在特定浓度下引发多相分离，形成包裹原凝聚相的新界面层，使αSyn重新分配至更外围的液相区间。这种界面工程策略为调控蛋白定位提供了新思路。

膜结构可引导αSyn远离凝聚相界面

当携带负电的脂质体（DOPG/DOPC）加入系统后，αSyn凭借其对膜界面更高的亲和力，随脂质体共同进入凝聚相内部，而非单独吸附于原界面。这种“界面竞争”效应提示细胞内多种膜结构可能天然具有调控蛋白相分布的功能。

αSyn从凝聚相界面移除可延缓聚集

ThT聚集动力学实验表明，添加3 mM ATP可使αSyn纤维化半衰期（t₅₀）延长达5倍，且该效应仅存在于含凝聚相的体系。EGFP-NPM1诱导的多相结构同样显著延缓聚集，而脂质体因可能同时提供成核界面则未显现抑制效果。动力学参数分析进一步证实，界面移除主要延长成核滞后时间（t_lag），对延伸速率（V_max）影响较小。

本研究通过定量揭示生物分子凝聚相界面吸附的物理化学规律，建立了“界面电荷-蛋白两亲性-吸附动力学-聚集速率”的完整关联框架。所提出的三种调控策略不仅深化了对细胞内蛋白相行为调控机制的理解，更为干预神经退行性疾病中异常蛋白聚集提供了可操作的分子工具。该研究标志着相分离研究从现象描述向精准调控的重要转变，为未来开发基于界面工程的治疗方案奠定了理论基础。