分子定义的小鼠全脑细胞图谱：各向同性单细胞分辨率的脑区功能细分新发现

《Nature Communications》：Molecularly defined cellular atlas of the entire mouse brain with isotropic single-cell resolution

　　本研究针对哺乳动物大脑神经元分子多样性及三维空间组织机制不清的难题，通过转基因小鼠模型结合fMOST（荧光显微光学切片断层成像）技术，首次构建了覆盖全脑的19种神经元和1种胶质细胞的单细胞分辨率三维分布图谱。研究实现了细胞坐标与Allen CCFv3标准脑图谱的精准对齐，揭示了皮层和皮层下核团中此前未知的细胞组成分区，并发现约1毫米尺度的脑区存在更精细的功能亚区结构。该成果为神经环路解析和脑疾病机制研究提供了关键数据支撑，相关资源已公开于MiCAM数据库（http://atlas.brainsmatics.cn/MiCAM）。

　　

大脑作为自然界最复杂的系统之一，由数以亿计的神经元通过精密连接形成网络。然而，这些神经元如何在大脑三维空间中有序排列，不同细胞类型如何形成功能特化的脑区，仍是神经科学领域的核心难题。传统研究多基于脑片技术，难以避免组织变形和采样偏差，而现有空间转录组学方法虽能识别细胞分子特征，却无法实现全脑尺度的单细胞精确定位。这一技术瓶颈限制了人们对脑功能架构的系统性认知。

为解决上述问题，来自海南大学、华中科技大学苏州脑空间研究院和武汉光电国家研究中心的研究团队，在《Nature Communications》上发表了题为“Molecularly defined cellular atlas of the entire mouse brain with isotropic single-cell resolution”的研究。该研究通过整合转基因荧光标记、fMOST高清成像和自动化细胞识别技术，建立了名为BrainCAD的平台，首次以各向同性单细胞分辨率绘制了小鼠全脑20种细胞类型（包括8种谷氨酸能神经元、5种GABA能神经元、6种调质神经元和1种小胶质细胞）的空间分布图谱。

关键技术方法概述

研究采用19种常用Cre转基因小鼠品系与LSL-H2B-GFP报告鼠杂交，通过fMOST技术以0.3×0.3×1 μm³的体素分辨率采集全脑荧光信号，结合碘化丙啶（PI）染色获取细胞构筑信息。利用NeuroGPS算法进行全脑细胞自动识别（稀疏区域准确率>95%），并通过BrainsMapi方案将数据配准至Allen CCFv3标准脑坐标系（Dice评分>0.9）。针对高密度细胞区域（如齿状回），开发了基于荧光信号体积的线性模型估算细胞数量。进一步通过立方网格分析（分辨率可调至10 μm）和莱顿聚类算法，解析细胞组成的空间异质性。

研究结果

1. 谷氨酸能神经元的组织模式

通过热图、三维重建和层次聚类分析，发现Camk2a⁺、Emx1⁺等广谱分布神经元与PlxnD1⁺、Scnn1a⁺等局部富集神经元在大脑皮层、海马、丘脑等区域呈现显著空间异质性。聚类分析将134个脑区划分为7类，其中簇1（C1）涵盖等皮层和异皮层的大部分区域，具有最丰富的谷氨酸能神经元多样性。100 μm网格分析进一步揭示了神经元在前-后、内-外轴向上的分布偏好，例如在尾壳核（CP）中，Thy1⁺神经元背外侧密集，而Camk2a⁺神经元集中于腹内侧。

2. GABA能神经元的分布特征

GAD2⁺和VGAT⁺神经元分布高度一致，但PV⁺、SOM⁺、VIP⁺神经元在皮层L4-L5、L5和L2/3层分别富集。聚类分析生成6个脑区簇，小脑（CB）特有的簇4（C4）以PV⁺神经元为主导。网格分析显示，在CA1区，GABA能神经元沿背外侧-腹内侧轴呈现多层分布，比谷氨酸能神经元的两层分化更为复杂。

3. 谷氨酸/GABA神经元平衡的空间映射

通过标准化Glu/GABA比值（Normed Glu/GABA）分析，发现皮层区域普遍呈谷氨酸能偏向（比值>0），而小脑为GABA能偏向（比值<0）。下丘脑、苍白球等区域比值接近0，体现兴奋-抑制平衡。在100 μm网格尺度上，该比值呈现出层状和内侧-外侧梯度，如中脑导水管周围灰质（PAG）背侧谷氨酸能偏向强于腹侧。

4. 调质神经元的全脑分布

胆碱能（ChAT⁺）、多巴胺能（TH⁺、DAT⁺）神经元偏好GABA能偏向区域，而促肾上腺皮质激素释放激素（CRH⁺）、血清素能（SERT⁺）和甘丙肽（GAL⁺）神经元倾向于谷氨酸能富集区。在延髓中，迷走神经背核（DMX）密集分布ChAT⁺、TH⁺和GAL⁺神经元，而中缝苍白核（RPA）富含CRH⁺、SERT⁺神经元。

5. 无监督聚类揭示全脑细胞组织模式

基于10 μm网格的19种神经元空间距离参数进行聚类，生成18个全脑簇。结果显示，聚类边界与解剖脑区高度吻合，如皮层L1、L2/3、L5/6层分别对应簇1-3。但未定带（ZI）被划分为前、中、后背侧、后腹侧4个亚区，其中后部SOM⁺神经元的壳状分布模式通过免疫荧光实验验证。在基底前脑（BF），聚类将腹侧苍白球（SI和MA）重新划分为内侧、外侧等4个功能亚区，突破了传统解剖边界。

6. 亚区功能验证案例

以尾壳核背外侧（CPdl）和腹外侧（CPvl）为例，钙信号记录发现运动过程中，CPdl谷氨酸能神经元反应峰值早于CPvl，而GABA能神经元仅在运动终止后出现差异。光遗传学刺激表明，激活CPvl谷氨酸能神经元或CPdl GABA能神经元均可显著增强运动能力，证实了亚区功能异质性。

结论与意义

本研究通过高分辨率全脑细胞图谱，揭示了神经元组成的空间模块化规律，不仅验证了已知脑区边界，还发现了多个尺度下的新功能亚区。所构建的MiCAM数据库为神经环路的细胞基础研究提供了精准空间坐标，有望推动脑疾病机制解析和神经调控策略开发。未来结合连接组学、单细胞形态重建等技术，将进一步深化对脑结构与功能关系的理解。