补充两种与宿主相关的Bacillus velezensis菌株可促进Micropterus salmoides和Channa argus的生长、抗氧化能力和肠道健康

《Aquaculture Reports》：Dietary supplementation with two host-associated Bacillus velezensis strains enhances growth, antioxidant, and gut health in Micropterus salmoides and Channa argus

　　宿主特异性芽孢杆菌MS-3和CA-1对鲈鱼和鲻鱼生长性能、抗氧化能力、免疫指标及肠道菌群的影响研究。实验表明两种益生菌可显著提高鱼类的增重率、饲料转化率、抗氧化酶活性及免疫相关基因表达，改善肠道结构，且宿主来源的益生菌效果优于异源菌株。

　　这项研究探讨了两种来源于不同宿主的**Bacillus velezensis**菌株（MS-3和CA-1）在促进鱼类健康和生长方面的潜力。实验对象是两种重要的淡水经济鱼类——**Micropterus salmoides**（大口黑鲈）和**Channa argus**（泥鳅），通过为期四周的水产养殖实验，评估了这两种菌株作为益生菌在提升鱼类体重增长、抗氧化能力、免疫反应和肠道微生物群组成方面的作用。研究结果表明，MS-3和CA-1菌株能够显著改善鱼类的生长表现，增强其抗氧化能力，提升免疫相关和消化酶的活性，改善肠道结构，并影响肠道微生物的组成。此外，研究还指出，这两种菌株可能表现出一定的宿主特异性，即它们在不同宿主中的效果存在差异。

### 一、研究背景

近年来，随着水产养殖业的快速发展，一些问题逐渐显现，例如遗传退化、水质污染以及病原微生物的过度繁殖，这些因素导致了频繁的疾病爆发，严重制约了水产养殖的可持续发展。为了解决这些问题，传统的做法是使用抗生素和化学药物来预防和控制疾病，但这种做法带来了诸多负面影响，包括抗生素残留、抗生素耐药性问题以及对鱼类自身免疫系统的抑制。因此，寻找抗生素的替代品成为当前研究的重点，其中益生菌因其天然来源、无残留风险以及对宿主免疫系统的积极作用，被认为是一种具有前景的解决方案。

益生菌在水产养殖中的应用已有广泛的研究基础，尤其是在提高鱼类生长性能、改善消化功能和增强免疫能力方面。在这些益生菌中，**Bacillus**属的菌株因其能产生多种酶类，具有强大的孢子形成能力，从而能够在宿主肠道中长期存活并发挥功能，因此在鱼类益生菌研究中占据重要地位。许多研究发现，**Bacillus**属的益生菌能够通过调节肠道微生物群、促进生长、改善消化能力、提供必需营养、增强抗应激能力以及调节宿主免疫等多种机制，为水产养殖提供支持。

然而，尽管已有大量研究涉及从不同宿主中分离的益生菌，目前尚缺乏对宿主特异性益生菌与非宿主特异性益生菌在提升宿主健康和养殖性能方面的直接比较。本研究旨在填补这一空白，通过比较从两种不同鱼类中分离出的**Bacillus velezensis**菌株（MS-3和CA-1）在两种宿主中的效果，探索它们在不同宿主中的表现差异，并评估它们是否具有宿主特异性。

### 二、研究方法

#### 1. 实验设计

实验共分为8组，分别对应两种鱼类（**M. salmoides**和**C. argus**）的4组对照和4组实验组。每组有3个重复的养殖池。**M. salmoides**和**C. argus**在实验开始前均被适应一周，以熟悉实验环境和喂食方式。之后，它们被随机分配到不同的实验组中，分别喂食含MS-3的饲料、含CA-1的饲料、两者混合的饲料（比例为1:1）以及对照饲料（不含益生菌）。实验持续30天，每天两次喂食，每次喂食量为鱼体重的2%。在实验过程中，研究人员观察了鱼类的摄食行为，并根据每周的摄食情况调整饲料量。此外，养殖水体的条件被严格控制，包括温度（26–28°C）、pH值（6.8±0.30）和溶解氧（>6.5 mg/L）。

#### 2. 饲料制备

实验中使用的益生菌菌株**Bacillus velezensis** MS-3和CA-1分别从**M. salmoides**和**C. argus**的肠道中分离得到。在实验前，这两种菌株被培养在Luria-Bertani培养基中，37°C、150 rpm摇床培养24小时。培养完成后，通过离心收集菌体，并将其重悬于1×PBS溶液中，调整至1×10^8 CFU/mL的浓度。然后，将菌悬液均匀喷涂在基础饲料上，每1000克饲料加入80毫升菌悬液，最终得到含8×10^6 CFU/g的益生菌饲料。对照饲料则不含益生菌，仅使用等体积的1×PBS溶液。

#### 3. 生长性能评估

实验结束后，研究人员对每组鱼类的体重增长（WG）、特定生长率（SGR）、饲料转化率（FCR）、体态系数（CF）、肝体比（HSI）和脏体比（VSI）进行了测量，以评估益生菌对鱼类生长的影响。

#### 4. 酶活性测定

通过测定肝脏、肠道和血清中的抗氧化酶（如超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和丙二醛MDA）以及免疫相关酶（如碱性磷酸酶AKP、酸性磷酸酶ACP、溶菌酶LZM和一氧化氮NO）的活性，来评估益生菌对鱼类抗氧化能力和免疫功能的影响。此外，还测定了消化酶（如α-淀粉酶AMS、脂肪酶LPS和胰蛋白酶Trypsin）的活性，以评估益生菌对鱼类消化能力的提升效果。

#### 5. 肠道组织学分析

为了进一步了解益生菌对肠道结构的影响，研究人员对肠道组织进行了苏木精-伊红（HE）染色和扫描电镜（SEM）观察。HE染色可以显示肠道的微观结构，而SEM则能够提供更详细的肠道表面结构信息。通过测量肠道微绒毛的高度、宽度和肠壁厚度，研究人员评估了益生菌对肠道结构的改善效果。

#### 6. 基因表达分析

采用实时定量PCR（RT-qPCR）技术，对肝脏和头肾中的免疫相关基因（如IL-1β、IL-8、IL-10、IFN-γ、IgM和TNF-α）进行了表达分析。这些基因在鱼类免疫系统中具有重要作用，例如IL-1β和TNF-α是促炎性细胞因子，而IL-10和IFN-γ则参与调节免疫反应和增强宿主的抗病能力。通过分析这些基因的表达水平，研究人员能够更深入地理解益生菌对鱼类免疫系统的调节机制。

#### 7. 肠道微生物群分析

通过16S rRNA基因测序技术，对肠道微生物群的组成进行了分析。研究人员使用HiPure Soil DNA Kit提取肠道内容物中的DNA，并通过PCR扩增16S rRNA基因的V3-V4高变区。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳验证后，进行高通量测序。随后，利用Alpha多样性分析（如Ace、Chao1、Shannon和Simpson指数）评估微生物群的丰富度和均匀度。同时，采用Beta多样性分析（UPGMA聚类树）来比较不同组之间的微生物群结构差异。

### 三、实验结果

#### 1. 生长性能

在**M. salmoides**的实验中，接受MS-3和CA-1益生菌处理的实验组（A2、A3、A4）在体重增长（WG）、特定生长率（SGR）和最终体重（FW）方面均显著高于对照组（A1），而在饲料转化率（FCR）方面则显著低于对照组。其中，A4组（混合益生菌）的FCR最低，表明其在提高饲料利用效率方面表现最佳。然而，CF、HSI和VSI等其他指标在各组之间没有显著差异。

在**C. argus**的实验中，同样观察到了类似的生长促进效果。实验组（B2、B3、B4）在体重增长、特定生长率和最终体重方面显著高于对照组（B1），而饲料转化率则显著下降。其中，B3组（CA-1）和B4组（混合益生菌）的FCR最低，表明CA-1在提高饲料利用效率方面表现优异。此外，B4组的HSI显著低于B1和B2组，可能与该组的生长模式有关。

#### 2. 抗氧化酶活性

在**M. salmoides**中，MS-3和CA-1处理组的SOD和CAT活性在血清、肝脏和肠道中均显著高于对照组。同时，这些处理组的MDA活性在血清和肝脏中均显著低于对照组，表明它们有效降低了脂质过氧化反应。而在**C. argus**中，实验组的SOD和CAT活性同样显著提升，MDA活性则显著下降。这说明这两种益生菌均能够增强鱼类的抗氧化能力，减少氧化应激带来的损伤。

#### 3. 消化酶活性

在**M. salmoides**和**C. argus**的实验中，MS-3和CA-1处理组的消化酶（如α-淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶）活性均显著高于对照组。其中，B3组（CA-1）的消化酶活性在**C. argus**中表现最佳，可能与该菌株对宿主的适应性有关。此外，实验组的消化酶活性在某些情况下高于对照组，表明益生菌能够促进鱼类对营养物质的吸收和利用。

#### 4. 肠道组织结构

通过HE染色和扫描电镜观察发现，MS-3和CA-1处理组的肠道微绒毛高度、宽度和肠壁厚度均显著增加，而对照组的这些指标相对较低。这表明益生菌能够改善肠道结构，提高其吸收能力和防御能力。在**C. argus**中，实验组的肠道微绒毛密度和杯状细胞数量也显著增加，进一步支持了益生菌对肠道结构的正向影响。

#### 5. 基因表达

在肝脏和头肾中，MS-3和CA-1处理组的免疫相关基因（如IL-1β、IL-8、IL-10、IFN-γ、IgM和TNF-α）表达水平均显著高于对照组。其中，B3组（CA-1）在**C. argus**中表现出更高的基因表达水平，特别是在肝脏和头肾中，表明其在免疫调节方面具有更强的潜力。这些结果表明，益生菌能够通过调控免疫相关基因的表达，增强鱼类的免疫功能。

#### 6. 肠道微生物群组成

在Alpha多样性分析中，**M. salmoides**的实验组（A2、A3、A4）的Ace和Chao1指数均显著高于对照组，表明益生菌增加了肠道微生物的多样性。而在**C. argus**的实验中，B2、B3和B4组的Ace和Chao1指数显著高于对照组，且Simpson指数在B2组中也显著增加，说明益生菌对肠道微生物的调控作用更明显。此外，肠道微生物群的组成分析显示，实验组中**Firmicutes**（厚壁菌门）的丰度显著增加，而**Bacteroidota**（拟杆菌门）的丰度减少，这可能与益生菌对肠道菌群的调节有关。

### 四、讨论与分析

#### 1. 益生菌的生长促进作用

研究结果表明，MS-3和CA-1两种益生菌均能显著提高**M. salmoides**和**C. argus**的生长性能。这一现象可能与益生菌促进营养物质吸收、提高消化酶活性以及增强免疫功能有关。通过提升消化酶活性，鱼类能够更有效地分解和吸收饲料中的营养成分，从而促进体重增长。同时，益生菌可能通过改善肠道结构，提高肠道的吸收效率，进一步支持鱼类的生长。

#### 2. 抗氧化能力的增强

在实验中，MS-3和CA-1均表现出增强鱼类抗氧化能力的潜力。SOD和CAT作为重要的抗氧化酶，能够清除体内的活性氧物质，减少氧化应激对细胞的损伤。MDA作为脂质过氧化的产物，其活性的降低表明益生菌能够有效抑制氧化反应，保护细胞免受损伤。这些结果表明，益生菌不仅能够提升鱼类的抗氧化能力，还可能通过减少氧化应激，提高其生存能力和抗病能力。

#### 3. 免疫功能的改善

免疫相关酶的活性增加，如ACP、AKP、LZM和NO，表明益生菌能够激活鱼类的非特异性免疫系统。其中，LZM能够破坏病原菌的细胞壁，增强其对病原体的防御能力；NO则作为信号分子，参与免疫细胞的激活和抗感染反应。此外，IgM作为鱼类特异性免疫反应中的主要抗体，其表达水平的提高意味着鱼类能够更有效地清除病原体，增强其免疫能力。

#### 4. 肠道结构的改善

肠道结构的改善是益生菌促进鱼类健康的重要机制之一。通过增加肠道微绒毛的高度和宽度，益生菌能够扩大肠道的吸收表面积，提高营养物质的吸收效率。同时，肠道壁厚度的增加可能增强了肠道的防御能力，减少病原菌的侵入。此外，杯状细胞数量的增加表明益生菌能够增强肠道黏液的分泌，进一步提高肠道的保护功能。

#### 5. 肠道微生物群的调控

肠道微生物群的组成对鱼类健康至关重要。益生菌通过调节肠道菌群，促进有益菌的生长，抑制潜在致病菌的繁殖，从而维持肠道菌群的动态平衡。Alpha多样性分析显示，实验组的微生物多样性显著高于对照组，这可能意味着益生菌促进了肠道微生物的丰富度和均匀度。同时，**Firmicutes**的丰度增加可能表明益生菌能够定植在肠道中，形成稳定的微生物群落，从而为宿主提供长期的健康支持。

#### 6. 宿主特异性的影响

研究还发现，MS-3和CA-1两种益生菌在不同宿主中的效果存在差异。例如，在**C. argus**中，CA-1处理组的某些指标（如FCR和免疫相关酶活性）优于MS-3处理组，这表明益生菌可能对宿主具有一定的特异性。这种特异性可能与益生菌与宿主之间的共生关系有关，即益生菌能够更好地适应宿主的肠道环境，从而发挥更强的益生作用。

### 五、研究意义与未来展望

本研究首次系统比较了从不同宿主中分离出的**Bacillus velezensis**菌株在促进鱼类健康和生长方面的效果。研究结果表明，这些益生菌不仅能够提高鱼类的生长性能，还能增强其抗氧化能力和免疫功能，改善肠道结构，并调节肠道微生物群的组成。此外，研究还发现，不同来源的益生菌在不同宿主中的效果存在差异，这提示我们益生菌可能具有宿主特异性，即它们在不同宿主中的表现可能不同。

这一发现对水产养殖业具有重要意义。首先，益生菌作为抗生素的替代品，能够减少抗生素的使用，降低抗生素残留和耐药性问题，从而保障食品安全和生态健康。其次，益生菌的宿主特异性表明，针对不同鱼类设计特定的益生菌配方可能更有效，从而提高养殖效益。此外，益生菌的广泛应用可能有助于构建更加健康的水产养殖生态系统，减少病原微生物的传播，提高鱼类的存活率和生长速度。

未来的研究可以进一步探讨益生菌对肠道屏障功能的影响，例如通过直接测量肠道紧密连接蛋白的表达，评估益生菌对肠道屏障的调控作用。此外，还可以研究益生菌在不同环境条件下的稳定性，以及它们对鱼类疾病预防和治疗的长期效果。通过这些研究，我们可以更全面地理解益生菌的作用机制，并为其在水产养殖中的应用提供科学依据。