使用经济高效的动态体外人体胃肠道模拟器对乳蛋白消化进行定量验证

《ACS Nutrition Science》：Quantitative Validation of Dairy Protein Digestion Using a Cost-Effective Dynamic In Vitro Human Gastrointestinal Simulator

　　动态体外消化模型SHIGAD通过模拟胃和小肠环境，验证了其生理相关性，包括胃酸化轨迹（pH 6.6→3.1，120分钟）、Elashoff排空模型（t1/2=30±3分钟，β=2.3±0.4），以及蛋白质降解动力学（SDS-PAGE显示casein快速降解，whey proteins肠道期完全分解）和氨基酸释放双相现象（OPA检测）。显微分析揭示了从酸性共凝到分散蛋白-脂质聚集的微结构演变。该系统具有高重复性（CV<10%），适用于食品科学和蛋白质质量评估。

　　食品的营养价值不仅取决于其化学成分，还受到其结构和基质对胃肠道消化、营养物质释放和生物可利用性的影响。因此，为了准确评估食品的真实功能表现，以及为产品设计提供科学依据，需要深入理解这些结构如何影响消化过程。近年来，随着新型食品基质（如植物基替代品）的兴起，这些产品在蛋白质组成、胶体组织以及某些调节消化与吸收的化合物（如多酚和纤维）方面与传统食品存在显著差异。为了验证这些产品的营养价值，有必要在生理相关的条件下进行严格的评估，尤其是在这些新型食品日益普及的背景下。

然而，进行体内消化研究往往面临伦理、物流和成本方面的挑战。因此，体外系统成为一种高价值的替代方案，因为它能够提供实验控制和良好的可重复性。然而，大多数静态体外模型由于使用固定的pH值、酶浓度和停留时间，对时间变化过程的模拟较为简单，可能影响对动力学的准确解释。相比之下，动态模型引入了变化的pH曲线、定时分泌物添加和可控的胃排空机制，以更好地模拟生理环境。尽管这些模型提供了高度的信息，但其基础设施需求和试剂消耗可能限制了其在需要灵活且成本效益高的评估中的应用。

基于此背景，我们开发并验证了SHIGAD（模拟人类胃肠动力系统），这是一种紧凑、低成本的两室动态体外消化系统，能够再现胃和小肠的条件。该系统采用可编程控制的关键参数，以模拟人体的消化过程。胃排空遵循Elashoff动力学模型，而胃的pH值变化则被设计为接近体内酸化情况。该协议遵循COST-INFOGEST共识，对模拟消化液和酶活性进行了标准化，同时结合了渐进酸化和接近中性的肠道pH控制。通过使用重组脱脂奶粉粉（SMP）作为模型基质，我们展示了SHIGAD在模拟胃酸化（pH从6.6降至3.1，耗时120分钟）和胃排空方面的表现，以及蛋白质降解过程。此外，该系统还具备高可重复性（变异系数<10%），并且具有操作简便和占地面积小的优势，降低了样本和试剂的需求，从而便于部署。

在材料与方法部分，我们详细描述了SHIGAD的构建和运行过程。该系统由两个室（胃和小肠）组成，置于恒温水浴中，并通过蠕动泵连接，实现自动胃排空。定制组件（如带有叶片的搅拌器、容器盖、支架等）采用CAD设计和3D打印技术制作，而玻璃反应容器、蠕动泵和辅助硬件则从商业渠道采购。系统内嵌的控制和监测应用程序负责记录每个室的pH值，并通过电磁阀按预设速率添加酶和电解质溶液。所有操作事件都带有时间戳，以确保同步性。此外，为了防止堵塞和交叉污染，系统采用了清洁在位（CIP）程序，确保每次运行之间的干净状态。

为了模拟消化过程，我们准备了模拟胃液（SGF）和模拟肠液（SIF），并根据INFOGEST共识进行了微调。胃电解质储罐中混合了SGF（不含酶）、0.3 M CaCl?和1 M HCl，以实现胃内pH值在120分钟内稳定降至3.1。肠电解质储罐中则包含了不含酶的SIF基液、CaCl?（从0.3 M储备液中加入）、胰蛋白酶（来自猪胰脏，酶活标准化）和胆盐（来自猪胆提取物），以达到与人体小肠生理一致的最终浓度。在口腔阶段，添加α-淀粉酶（人类唾液）以实现每毫升75单位的活性。在胃阶段，猪胃蛋白酶的最终活性被设定为每毫升2000单位。在肠阶段，胰蛋白酶的活性被设定为每毫升100单位。所有酶的活性均通过标准实验进行验证，并根据酶活结果对批次间的一致性进行标准化处理。

在实验结果部分，我们展示了SHIGAD在模拟胃酸化和胃排空方面的性能。胃pH值曲线在120分钟内呈现出与体内一致的特征，显示出一个缓冲平台期后逐渐下降的趋势。此外，胃排空动力学通过Elashoff模型进行拟合，得出半排空时间（t?/?）为30±3分钟，形状参数（β）为2.3±0.4。质量回收率平均为99.0%±2.5%，表明系统运行稳定，几乎没有物质损失，所有测量的变化都能真实反映营养物质在胃与肠之间的转移情况。

在蛋白质水解方面，SHIGAD表现出与预期相符的阶段特异性动力学。通过SDS–PAGE分析，我们观察到胃阶段中酪蛋白带的强度逐渐减弱，而乳清蛋白（如β-乳球蛋白）在胃阶段基本保持不变。进入肠阶段后，胰蛋白酶迅速降解剩余的酪蛋白肽和完整的乳清蛋白，导致这些蛋白带消失，同时自由α-氨基基团的释放量显著上升。OPA测验显示，自由α-氨基基团的释放呈现出双相上升的趋势，这与胃和肠阶段中蛋白质降解的两步过程相一致。SDS–PAGE的密度分析进一步支持了这一结果，表明酪蛋白在前30–60分钟内减少了40–50%，而乳清蛋白的减少则发生在肠阶段。

此外，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析揭示了消化过程中食品基质的微结构变化。在口腔阶段，蛋白质和脂质呈现均匀分布；进入胃阶段后，蛋白质开始聚集，形成酸诱导的凝块，其中脂质滴被嵌入或附着在蛋白质网络的周围；而在肠阶段，这些凝块被分解成更小的蛋白质-脂质聚集物，脂质滴更加分散。定量图像分析进一步验证了这些结构变化，显示脂质和蛋白质颗粒的直径逐渐减小，而脂质滴之间的最近邻距离则随时间增加。这些变化表明，食品基质在消化过程中经历了从均匀分散到聚集再到分散的演变过程。

在可重复性方面，SHIGAD表现出极高的稳定性，其胃pH值暴露面积（AUC）、半排空时间和最终水解程度的变异系数均小于10%。为了提供更全面的背景，我们还引入了一个单终点INFOGEST静态消化实验，以对比SHIGAD的输出。尽管静态实验提供了整体的水解终点估计，但SHIGAD能够实时捕捉胃pH值变化、排空和蛋白质水解之间的耦合关系，这是静态实验所无法实现的。动态控制的酸化和排空机制保留了现实的酶-底物比例，并持续移除消化产物，从而在生理相关的条件下增强动力学的可解释性。

在讨论部分，我们强调了SHIGAD在模拟人体消化过程中的优势。该系统不仅能够再现关键的生理特征，还具有成本效益和操作简便的特点。相比传统的大型动态模型，如TIM-1和SIMGI，SHIGAD在保持高度生理相关性的同时，大幅降低了技术复杂性和成本。例如，TIM-1研究显示的乳蛋白消化速率和胃排空时间与我们的发现一致，表明SHIGAD在核心动力学方面与大型系统相当。此外，SHIGAD能够模拟蛋白质和脂质的相互作用，以及消化过程中这些相互作用如何影响营养物质的释放。这种动态模拟为研究食品结构如何调节营养释放动力学提供了新的视角。

尽管SHIGAD已经成功模拟了胃和小肠的消化过程，但仍存在一些局限性。例如，胃出口的滤网仅使用了固定的2毫米孔径，没有对实时颗粒大小进行反馈调节；营养依赖的十二指肠反馈机制未被建模，因此排空过程是预编程的，而不是对消化物成分的反应；此外，系统未包括结肠发酵模块，因此无法研究残留肽或未消化蛋白质在结肠中的微生物转化过程。未来的工作将扩展SHIGAD的功能，例如集成动态口腔消化模块，以生成标准化的基质样本，从而更好地模拟人体的咀嚼和唾液混合过程。同时，未来版本可能包括结肠反应器，以研究残留物质的发酵过程，以及将SHIGAD与细胞培养系统（如Caco-2细胞）连接，以评估氨基酸和肽的吸收与转运。

展望未来，SHIGAD有望成为食品科学和营养研究的重要工具。它不仅适用于传统乳制品的评估，还可用于新兴植物基食品基质的分析。通过调整酶和辅因子（如唾液和胰液中的淀粉酶、胆盐），该系统可以灵活配置以研究碳水化合物和脂质的消化过程。此外，SHIGAD可以结合先进的分析方法，如肽质量谱分析或代谢组学，以深入理解消化过程中的分子事件。这些扩展将提高系统的生物相关性，使其成为更准确预测人类营养和生理结果的平台。

总体而言，SHIGAD为食品科学和营养研究提供了一种高效、低成本的动态体外消化模型。通过精确控制温度和pH值，以及模拟胃排空过程，该系统能够再现人体消化过程中的关键特征。其紧凑的设计和高可重复性使其特别适用于研发和筛选流程，例如迭代配方优化、方法开发和质量控制支持。这些特性使得SHIGAD成为研究不同食品基质中蛋白质消化性的实用工具，不仅适用于传统乳制品，还适用于新兴的植物基替代品。尽管目前系统主要关注胃和小肠阶段，但未来可以通过集成结肠反应器和细胞培养系统，进一步扩展其功能，以全面评估食品在人体内的消化和吸收过程。