牙龈上皮中的乙酰胆碱参与了牙周炎的发病机制

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Acetylcholine in the gingival epithelium drives the pathogenesis of periodontitis

　　乙酰胆碱通过调控牙龈上皮细胞屏障修复和促进炎症反应的双重机制参与牙周炎病理进程，单细胞测序和空间转录组学揭示上皮细胞中非α7型尼古丁受体表达特征，动物实验证实外源性乙酰胆碱加剧骨吸收。

　　### 一、研究背景

牙周炎是一种常见的慢性炎症性疾病，其特点是牙周组织的逐渐破坏，最终可能导致牙齿脱落，并对全身健康产生影响。这种病理过程不仅涉及上皮屏障的破坏，还受到免疫系统失调引发的炎症反应的持续作用。虽然神经递质，如乙酰胆碱，在唾液和牙龈沟液中普遍存在，但其在牙周炎发病机制中作为关键免疫稳态调节因子的作用仍不明确。乙酰胆碱在多种器官系统中已知能够通过“胆碱能抗炎通路”调节炎症和组织完整性，该通路通常涉及α7型烟碱乙酰胆碱受体（α7nAChR）并被认为具有保护作用。然而，目前对乙酰胆碱在牙龈组织这一独特炎症微环境中具体功能及其调控机制仍缺乏深入理解。

为了全面探讨牙周炎的细胞和分子变化，本研究采用整合方法，结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和已发表的空间转录组学数据。通过分析来自健康、牙周炎以及接受治疗的牙周炎患者的大量人类牙龈样本，我们旨在识别最受影响的神经信号通路，并绘制其对应受体的空间分布。此外，我们还通过体外和体内实验验证了乙酰胆碱的功能作用。

### 二、研究方法

#### 2.1 细胞培养

本研究使用了永生化的口腔角质形成细胞系HOK-16B，将其以每孔4×10^5个细胞的密度接种于六孔板中。细胞在含有定义的角质形成细胞培养基（Gibco）以及0.2%的定义角质形成细胞生长补充剂（Gibco）和1%的青霉素-链霉素的条件下培养。培养环境为37°C、湿度保持在50%以上、5%的CO2浓度。在细菌刺激前，细胞被用无生长补充剂的培养基饥饿处理2小时。

#### 2.2 细菌培养

本研究使用标准菌株ATCC 33277的牙龈卟啉单胞菌（*Porphyromonas gingivalis*，简称*P. gingivalis*）进行培养。*P. gingivalis*在厌氧条件下（80% N2、10% H2、10% CO2）于37°C培养，培养基为胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）并添加0.1%的酵母提取物、1 μg/mL的维生素K和5 μg/mL的血红素（pH 7.46）。细菌被接种于TSB琼脂平板后，再转移至液体培养基中培养至对数生长期。通过比浊法测定细菌浓度，OD 1.0相当于每毫升10^9个*P. gingivalis*。随后，将*P. gingivalis*用无菌生长培养基重悬至10^10个/mL，并以50的感染倍数（MOI）进行刺激。

#### 2.3 细胞免疫荧光

HOK-16B细胞在12孔板中接种至每孔2×10^5个细胞，并在覆盖玻璃片上培养至50%汇合。细胞随后被*P. gingivalis*刺激24小时。固定后，细胞被用4%多聚甲醛（PFA）固定20分钟，并用0.5% Triton X-100透化10分钟。随后，使用含1% BSA和5%正常山羊血清的封闭缓冲液封闭1小时。过夜孵育中使用了小鼠抗NLRP3（1:500，Proteintech）和兔抗ASC（PYCARD）（1:500，Proteintech）作为一抗。随后，使用荧光标记的二抗（CoraLite Plus 488-Goat Anti-Mouse Recombinant Secondary Antibody和CoraLite Plus 647-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody）进行孵育，并用CoraLite 594-Phalloidin抗体标记细胞骨架。最后，使用抗褪色载玻片和DAPI染色进行封片，并通过Olympus FV 3000激光扫描共聚焦显微镜进行成像。为提高视觉区分度，对594和647通道进行了伪彩色调整。

#### 2.4 酶联免疫吸附测定（ELISA）

将人口腔角质形成细胞（HOKs）分别与乙酰胆碱和*P. gingivalis*单独或联合处理后，细胞被转移到新的培养基中（用于去除*P. gingivalis*）培养2小时，收集上清液。使用ELISA试剂盒（Proteintech）检测上清液中CXCL1和CXCL8的水平，按照制造商的说明进行操作。简要步骤包括将样品和标准品加入预包被的孔中，孵育后加入检测抗体和HRP标记的二抗，启动酶反应后加入TMB底物并停止反应，最后使用微孔板读数仪在450 nm波长下读取光密度，根据标准曲线计算蛋白浓度。

#### 2.5 RNA提取和定量实时PCR（qPCR）

使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA，并使用PrimeScript RT Reagent Kit（Vazyme Biotech）进行逆转录生成第一链cDNA。定量实时PCR（qPCR）在Roche LightCycler 480 II系统上进行，使用SYBR qPCR Master Mix（Yeasen Biotechnology）。合成的人类特异性引物由Generay Biotech提供，包括OCLN、CLDN1、CDH1和GAPDH。基因表达水平使用2^?ΔΔCT方法计算，并以GAPDH作为内参基因进行标准化。

#### 2.6 受试者招募与组织样本采集

本研究收集了三名牙周炎患者的牙龈组织样本，这些患者在中山大学附属口腔医院口腔颌面外科接受拔牙手术。所有样本采集均遵循中国“药物临床试验良好临床实践”、ICH-GCP指南及相关法规，并经中山大学附属口腔医院医学伦理委员会批准（批准号：KQEC-2022-14-01）。在纳入研究前，所有参与者均签署知情同意书。牙周炎患者的纳入标准包括受累牙齿的探针深度（PD）>4 mm，且探针出血指数（BI）≥3。排除标准为患有并发系统疾病的患者。

#### 2.7 组织处理与免疫荧光

收集的牙龈组织被放置于Hank’s平衡盐溶液中，并在4% PFA中固定10分钟，随后在4°C下进一步固定24小时。组织依次经过分级乙醇脱水（70%–100%）、二甲苯透明化和石蜡包埋。制备连续5 μm切片后，于60°C下烘焙2小时，再通过分级乙醇重新水化，进行免疫荧光染色。使用柠檬酸缓冲液（pH 6.0）进行抗原修复，随后使用封闭缓冲液（1% BSA/5%正常山羊血清）封闭1小时。切片在4°C下过夜孵育兔抗乙酰胆碱酯酶（ACHE）多克隆抗体（1:500，Proteintech），再使用CoraLite 488-标记的山羊抗兔IgG（H + L）进行孵育。切片使用抗褪色载玻片和DAPI进行封片，并通过Olympus FV 3000激光扫描共聚焦显微镜进行成像。

#### 2.8 小鼠牙周炎模型

本研究的动物使用协议经中山大学动物伦理委员会批准（编号：SYSU-IACUC-2024-000348），并符合美国《动物福利法》和美国公共卫生服务的《实验室动物护理与使用指南》。所有动物均在无特定病原体（SPF）环境中饲养，保持恒定的湿度和温度，并在12小时光照-黑暗周期下生活。

小鼠被随机分为健康对照组（HC）、牙周炎组（PD）和牙周炎+乙酰胆碱治疗组（PD + ACh）。在麻醉（戊巴比妥/乙醚）后，通过在上颌第二磨牙周围放置0.15 mm直径的丝线来诱导牙周炎，丝线在近中和远中侧均被系紧。每3天在异氟烷麻醉下，向小鼠施加1×10^10 CFU/mL的*P. gingivalis*悬液。在PD + ACh组中，每天使用新鲜配制的乙酰胆碱溶液进行治疗，而PD组则接受相同pH值的对照溶液。14天后，小鼠被安乐死，收集上颌块并用4% PFA固定。在丝线脱落前的小鼠被排除。通过微型CT（micro-CT）评估骨丧失。此外，采用随机数据处理方法以减少潜在的混杂因素。

在用二钠乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙后，小鼠上颌骨被包埋于石蜡中，切成5 μm厚的切片，并进行苏木精-伊红（H&E）染色。通过显微镜观察上颌和舌侧的连续切片，并使用PANNORAMIC SCAN扫描仪进行成像。

#### 2.9 统计分析

数据使用GraphPad Prism 10进行分析，并以均值±标准误（SEM）表示。统计显著性采用t检验（用于两组比较）和单因素方差分析（用于三组或更多组的比较，随后使用Tukey的HSD事后检验）。显著性差异表示为：*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

#### 2.10 RNA测序

文库制备：使用TRIzol试剂（Invitrogen）从HOKs中提取总RNA，并使用PrimeScript RT Reagent Kit（Vazyme Biotech）进行逆转录生成第一链cDNA。定量实时PCR（qPCR）在Roche LightCycler 480 II系统上进行，使用SYBR qPCR Master Mix（Yeasen Biotechnology）。合成的人类特异性引物由Generay Biotech提供，包括OCLN、CLDN1、CDH1和GAPDH。基因表达水平使用2^?ΔΔCT方法计算，并以GAPDH作为内参基因进行标准化。

### 三、研究结果

#### 3.1 单细胞和空间转录组学图谱揭示牙龈组织在牙周健康与疾病中的细胞景观

本研究使用的scRNA-seq数据包含205,334个细胞，来自40个样本，分为健康对照组（HC，19个）、牙周炎组（PD，15个）和治疗后牙周炎组（TP，6个）（见表1；图1A）。这些数据由Caetano等（2021）、Williams等（2021）、Chen等（2022）和Zhu和Huang（2023）发表。空间转录组学数据包括HC和PD样本，共有46,230个25 μm2的伪斑点（见Shen等，2024）。

通过质量控制，我们使用经典标记（Williams等，2021）将单细胞群体分类为免疫细胞（PTPRC和IGKC）、成纤维细胞（COL1A1和LUM）、内皮细胞（VWF和RAMP2）和上皮细胞（KRT14和COL17A1）（见图1B、C）。定量细胞分析表明，上皮细胞是最少的群体，而免疫细胞是最主要的群体。牙周炎组表现出显著的免疫细胞浸润和上皮细胞减少（见图1D），这反映了牙周炎中观察到的病理炎症组织破坏（Kim等，2024）。

空间转录组学分析进一步揭示了牙龈组织中的细胞分布（见图1E）。KRT15（基底上皮标记）清晰地界定了上皮与固有层之间的边界，而PTPRC（广义免疫标记）显示了牙周炎中免疫细胞的空间浸润。

#### 3.2 上皮细胞在牙周炎中表现出最显著的神经递质信号相关基因重编程

通过分析高变异基因（HVGs）和神经递质信号相关基因集合，我们发现内皮细胞表现出最广泛的神经信号相互作用（见图2A）。内皮细胞高度表达G蛋白（GNG11和GNAI2），这些蛋白作为神经递质受体（如GPCR）信号传导的“开关”（Liccardo等，2022），以及信号传导和囊泡运输的关键调节因子，如RAC1和RAB11A（Hulsbusch等，2015）。这一观察结果可归因于微血管的密集交感神经和感觉神经支配，其中内皮细胞能够迅速传递神经信号，以调节局部血流和炎症细胞外渗（de Juan等，2019；Forrester等，2024）。

上皮细胞则表现出独特的神经递质受体表达模式，其中高表达CHRNB1（乙酰胆碱受体β1亚基）和CHRNA5（乙酰胆碱受体α5亚基），而经典抗炎受体CHRNA7（乙酰胆碱受体α7亚基）的表达水平较低（见图3B）。我们进一步通过空间转录组学数据验证了这一受体表达模式（见图3C、D），表明乙酰胆碱在牙龈上皮中的作用可能不同于其经典的α7nAChR依赖性抗炎作用。

#### 3.3 牙龈胆碱能代谢酶的表达模式

我们的研究显示，牙龈组织中核心的乙酰胆碱合成酶CHAT在驻留细胞中几乎未检测到，这表明乙酰胆碱可能主要来源于局部神经网络的释放或唾液和牙龈沟液中的存在（Ferreira-Vieira等，2016）。相反，乙酰胆碱酯酶（AChE）在髓样免疫细胞和血管内皮中显著表达，并在牙周治疗后表达水平显著升高，这提示牙龈组织能够主动调节局部乙酰胆碱浓度（Korabecny和Soukup，2021）。

免疫荧光实验显示，AChE蛋白主要定位在免疫细胞群和血管内皮中（见图4A，圆圈和箭头）。箱线图分析表明，上皮细胞中AChE的表达水平低于其他细胞类型（见图4B）。总体而言，髓样免疫细胞中AChE的表达水平最高，甚至高于内皮细胞和成纤维细胞（见图4C）。进一步细分免疫细胞后，发现巨噬细胞、经典树突状细胞和单核细胞在牙周治疗后高度表达AChE（见图4D、E）。空间转录组学图谱进一步表明，这些髓样免疫细胞在牙周炎上皮区域显著浸润，并且在牙周治疗后其AChE表达显著上调，提示存在一种反馈机制，调节局部乙酰胆碱浓度，从而促进上皮稳态的恢复。

#### 3.4 乙酰胆碱促进牙周上皮屏障修复和趋化因子表达

在体外实验中，我们观察到乙酰胆碱能够通过逆转*P. gingivalis*诱导的紧密连接破坏，从而促进牙周上皮屏障的修复（见图5D）。这一结果与空间转录组学中牙周炎上皮中紧密连接蛋白表达普遍上调的发现相一致，并突显了其在促进组织修复和维持黏膜防御中的潜力（France和Turner，2017）。

然而，乙酰胆碱同时加剧了炎症反应，通过增加促炎性趋化因子（CXCL1和CXCL8）和炎性体成分（NLRP3和ASC）的表达和分泌（见图6B、C、D、E）。这一现象尤为重要，因为上皮细胞是牙周病原菌的第一道防线，并且直接接触唾液和牙龈沟液中的大量神经递质（Sakallioglu等，2008；Takahashi等，2019）。在小鼠模型中，乙酰胆碱的局部应用导致牙周组织破坏和骨丧失加剧（见图7C、D），这表明在活跃的疾病状态下，其促炎性作用超过了屏障保护功能，最终导致组织损伤和牙槽骨密度下降（Zhang等，2024）。

#### 3.5 乙酰胆碱加剧炎性体产生和牙周破坏

HOKs在单独使用乙酰胆碱、单独使用*P. gingivalis*或两者联合处理后，表现出炎性体成分的显著上调，包括NOD样受体家族含吡啶结构域3（NLRP3）和凋亡相关斑样蛋白（ASC）（见图7A、B）。类似地，趋化因子的上调有助于清除病原体，但同时也可能加剧组织损伤（Sharma和Kanneganti，2021；Fu和Wu，2023）。

尽管这些发现表明乙酰胆碱在牙周炎中具有双重作用，但本研究仍存在一些局限性。首先，特定细胞类型与神经信号变化之间的因果关系仍需进一步的功能验证。其次，体外实验中未使用AChE抑制剂，这可能影响角质形成细胞内源性胆碱酯酶的稳定性及乙酰胆碱在培养基中的有效浓度。此外，尽管小鼠模型在研究中具有重要价值，但其可能无法完全模拟人类牙周病的复杂性。未来的研究应着重于阐明CHRNB1和CHRNA5介导的促炎性和屏障保护作用的具体分子机制，并探讨针对这些受体的药理学干预是否可以成为调控牙周炎症和促进组织再生的可行策略。

### 四、讨论

本研究通过整合单细胞RNA测序和空间转录组学分析，结合体外和体内实验，揭示了乙酰胆碱信号在牙周炎中的新角色。我们发现，尽管多种细胞类型参与神经信号的交互，但牙龈上皮细胞在从健康到牙周炎的进展过程中表现出最显著的神经递质信号相关基因表达重编程，尤其是在胆碱能突触通路方面。进一步研究显示，上皮细胞表达独特的胆碱能受体谱，包括高表达的非α7型烟碱乙酰胆碱受体（CHRNB1和CHRNA5），以及低表达的抗炎型受体（CHRNA7）。这一受体表达模式在HOKs中也得到了验证，表明乙酰胆碱在牙龈上皮中的作用可能不同于其经典的α7nAChR依赖性抗炎通路。

此外，我们对胆碱能代谢酶的分析提供了对牙龈胆碱能微环境的深入见解。CHAT在驻留细胞中几乎未检测到，提示乙酰胆碱可能主要来源于局部神经网络的释放或唾液和牙龈沟液中的存在。相比之下，AChE在髓样免疫细胞和血管内皮中显著表达，并且在牙周治疗后表达水平显著升高，这表明牙龈组织能够主动调节乙酰胆碱水平。空间转录组学图谱显示髓样免疫细胞在牙周炎上皮区域显著浸润，并且在牙周治疗后其AChE表达显著上调，这提示存在一种反馈机制，通过调节局部乙酰胆碱浓度，从而促进上皮稳态的恢复。

我们的体外和体内实验进一步揭示了乙酰胆碱的复杂和看似矛盾的作用。一方面，乙酰胆碱通过逆转*P. gingivalis*诱导的紧密连接破坏，表现出屏障保护作用；另一方面，乙酰胆碱通过上调促炎性趋化因子和炎性体成分，加剧了炎症反应。这一双重作用在小鼠模型中得到了验证，即局部应用乙酰胆碱导致牙周组织破坏和骨丧失加剧，这表明在活跃的疾病状态下，其促炎性作用超过了屏障保护功能。

尽管这些发现具有重要的临床意义，但本研究仍存在一定的局限性。首先，特定细胞类型与神经信号变化之间的因果关系仍需进一步的功能验证。其次，体外实验中未使用AChE抑制剂，这可能影响角质形成细胞内源性胆碱酯酶的稳定性及乙酰胆碱在培养基中的有效浓度。此外，尽管小鼠模型在研究中具有重要价值，但其可能无法完全模拟人类牙周病的复杂性。未来的研究应着重于阐明CHRNB1和CHRNA5介导的促炎性和屏障保护作用的具体分子机制，并探讨针对这些受体的药理学干预是否可以成为调控牙周炎症和促进组织再生的可行策略。