CLOCK介导NF-κB p65乙酰化驱动乳腺癌免疫逃逸的机制研究

《Biology Direct》：CLOCK-mediated acetylation of NF-κB p65 drives immune evasion in breast cancer

　　本研究针对乳腺癌免疫逃逸机制不明确的问题，通过系统分析TCGA等数据库和实验验证，发现核心生物钟基因CLOCK通过乙酰化NF-κB p65第56位赖氨酸(K56)增强PD-L1转录，促进免疫抑制微环境形成。该研究为乳腺癌预后判断和免疫治疗策略提供了新的生物标志物和理论依据。

　　

当夜幕降临，大多数人进入梦乡时，我们的身体内部却在进行着一场精密的计时活动——昼夜节律调节。这种内在的生物钟系统不仅调控着我们的睡眠-觉醒周期，更与多种疾病的发生发展密切相关。特别是在乳腺癌这一全球女性最常见的恶性肿瘤中，越来越多的证据表明，轮班工作、夜间光照等导致的昼夜节律紊乱与乳腺癌发病风险增加存在显著关联。然而，生物钟基因如何影响乳腺癌的进展及其与肿瘤免疫微环境的相互作用机制，仍是当前研究的空白点。

在这项发表于《Biology Direct》的研究中，权心玉等人深入探讨了核心生物钟基因CLOCK在乳腺癌中的表达特征、临床意义及作用机制。研究人员发现，CLOCK在乳腺癌组织中显著高表达，且与患者不良预后密切相关。进一步的研究揭示，CLOCK通过其特有的乙酰转移酶活性，直接乙酰化转录因子NF-κB的p65亚基第56位赖氨酸残基，从而增强其对免疫检查点分子PD-L1的转录激活能力，最终促进乳腺癌细胞的免疫逃逸。

为开展此项研究，团队综合运用了生物信息学分析和实验验证相结合的策略。他们从TCGA和METABRIC数据库获取乳腺癌患者的转录组、突变、甲基化及临床资料，通过单因素Cox回归和Kaplan-Meier生存分析评估生物钟基因的预后价值；利用ssGSEA算法评估免疫细胞浸润，并通过TIDE评分预测免疫治疗反应。实验方面，研究人员构建了CLOCK过表达和敲低的MCF-7细胞系，采用RNA测序、免疫共沉淀、GST pull-down、体外乙酰化 assay、染色质免疫沉淀等技术，从分子水平验证了CLOCK-p65-PD-L1信号轴的功能机制。

CLOCK和RORB构建预后风险模型并作为乳腺癌的独立指标

研究人员首先系统分析了14个核心生物钟基因在乳腺癌中的表达、突变和甲基化特征。结果显示，除ARNTL和CRY1外，其余生物钟基因在癌与癌旁组织间均存在差异表达，其中CLOCK、ARNTL2和RORC显著上调，而CRY2、PER1/2/3等基因明显下调，表明乳腺癌中存在生物钟基因表达的普遍紊乱。生存分析发现，CLOCK和RORB的高表达与患者总生存期缩短独立相关，基于二者构建的昼夜节律风险评分(CC_score)在TCGA和METABRIC队列中均能有效预测患者预后，且在多因素分析中保持独立性。

CLOCK在乳腺癌细胞进展和化疗耐药中的功能作用

通过建立CLOCK过表达和敲低的MCF-7细胞模型，研究发现CLOCK过表达显著促进细胞增殖和迁移，而敲低CLOCK则抑制这些恶性表型。在化疗药物敏感性方面，CLOCK高表达使细胞对阿霉素( Doxorubicin)和吉西他滨(Gemcitabine)的耐药性增强，而敲低CLOCK则增加细胞对化疗药物的敏感性，表明CLOCK在乳腺癌化疗耐药中发挥重要作用。

CLOCK与免疫微环境和治疗反应的关联

分析TCGA数据库发现，CLOCK高表达组PD-L1(CD274)、HAVCR2等免疫检查点分子表达上调，而CD8⁺ T细胞、NK细胞等抗肿瘤免疫细胞浸润减少，M2型巨噬细胞等免疫抑制细胞增多。值得注意的是，CLOCK高表达组TIDE评分较低，提示这类患者可能对PD-1抑制剂纳武利尤单抗(Nivolumab)治疗更敏感。

CLOCK调控的NF-κB信号通路促进免疫逃逸和肿瘤进展

RNA测序结果显示，CLOCK敲低后NF-κB、TNF、MAPK等信号通路相关基因显著下调。实验验证发现，CLOCK敲低使NF-κB下游靶基因TNF、CXCL8、CXCL1表达降低，同时PD-L1的mRNA和蛋白水平也下降，而CLOCK过表达则呈现相反效果。这些结果表明CLOCK通过调控NF-κB通路影响PD-L1表达。

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CLOCK与NF-κB p65相互作用并在Lys56位点乙酰化p65

免疫共沉淀和GST pull-down实验证实CLOCK与p65存在直接相互作用。体外乙酰化实验表明CLOCK能够乙酰化p65，质谱分析鉴定出K56为特异性乙酰化位点。点突变实验进一步验证K56R突变完全消除了CLOCK介导的p65乙酰化。

NF-κB p65 Lys56乙酰化促进PD-L1转录

功能实验表明，p65-K56R乙酰化缺陷突变体失去了促进PD-L1转录的能力。染色质免疫沉淀显示K56R突变减弱了p65与PD-L1启动子的结合。更重要的是，CLOCK对PD-L1表达的促进作用完全依赖于p65 K56位点的乙酰化修饰。

本研究首次揭示了CLOCK通过乙酰化NF-κB p65第56位赖氨酸调控PD-L1表达的新机制，为理解生物钟基因在肿瘤免疫逃逸中的作用提供了重要理论依据。研究发现不仅确立了CLOCK作为乳腺癌预后生物标志物的临床价值，更重要的是揭示了昼夜节律调控与肿瘤免疫之间的分子联系，为开发针对生物钟-免疫轴的新型肿瘤治疗策略奠定了基础。尽管研究存在缺乏体内实验验证等局限性，但其发现的CLOCK-p65-PD-L1信号轴为乳腺癌免疫治疗提供了新的靶点思路，特别是针对具有昼夜节律紊乱高危因素的乳腺癌患者，可能具有重要的个体化治疗指导意义。