多轮紫外诱变强化米曲霉LL1亮氨酸氨肽酶活性及其在大豆蛋白脱苦中的应用研究

《Biotechnology Letters》：Enhancing leucine aminopeptidase activity in Aspergillus oryzae LL1 through multi-round UV irradiation mutagenesis with potential application in debittering

　　本研究针对米曲霉（Aspergillus oryzae）LL1菌株的亮氨酸氨肽酶（LAP）活性提升需求，通过三轮紫外（UV）诱变与定向筛选，成功获得LAP比活性提升1.74倍的突变株U03。该突变株可高效水解大豆分离蛋白，显著增加小肽片段和游离氨基酸含量，为蛋白水解物脱苦工艺提供了潜力显著的酶资源。

　　

在食品工业中，蛋白质水解物常因含有大量疏水性氨基酸而产生苦涩味，严重影响产品风味和消费者接受度。亮氨酸氨肽酶（Leucine Aminopeptidase, LAP）能够特异性水解多肽链N末端的疏水性氨基酸，从而有效降低苦味，但天然菌株的LAP产量和活性往往难以满足工业化需求。米曲霉（Aspergillus oryzae）作为一种公认安全（GRAS）的真菌，其分泌的LAP在传统发酵食品中已有广泛应用，然而如何进一步提升其酶活性仍是当前研究的重点。

为突破这一瓶颈，研究人员以米曲霉LL1为出发菌株，通过多轮紫外（UV）诱变结合活性筛选，成功培育出LAP活性显著提升的突变株。该研究发表于《Biotechnology Letters》，系统评估了突变株的催化效率及其在大豆蛋白脱苦中的应用潜力。

研究主要采用紫外诱变、酶活性测定（以N-琥珀酰-L-亮氨酸-对硝基苯胺为底物）、蛋白质电泳（SDS-PAGE）、反相高效液相色谱（RP-HPLC）及游离氨基酸分析等关键技术方法。其中，突变株的筛选基于LAP比活性稳定性测试，并通过对大豆蛋白水解产物的多维度分析验证其脱苦效果。

LAP活性通过诱变技术提升

经过三轮紫外诱变（剂量分别为15 J/m²、15 J/m²和20 J/m²），从总计780个突变克隆中筛选出三株稳定性优异的突变株U01、U02和U03。其中，U03的LAP比活性达到556.5 mU/mg，较野生型LL1（319.9 mU/mg）提升1.74倍，且其粗酶液中的总酶活提升至414.4 mU/mL。

突变株U03展示高效大豆蛋白水解能力

SDS-PAGE结果显示，U03粗酶液在6小时内即可将大豆蛋白彻底降解为小分子肽段，而野生型LL1的降解效率显著较低。RP-HPLC分析进一步证实，U03处理组在保留时间13.6、16.9和20.4分钟处的肽段峰面积显著增加，表明其水解速率更快、更彻底。

游离氨基酸释放量显著增加

游离氨基酸分析表明，U03水解6小时后释放的总游离氨基酸含量达996.3 mg/L，较LL1（686.3 mg/L）提升45%。其中，疏水性氨基酸（如亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和酪氨酸）的释放量均显著高于野生型，证实其高效脱苦潜力。

研究通过多轮紫外诱变成功获得LAP活性显著提升的米曲霉突变株U03，其粗酶液在降解大豆蛋白时表现出高效的水解能力和脱苦潜力。该成果为开发低成本、高效率的蛋白脱苦酶制剂提供了重要菌种资源，在传统发酵食品和植物蛋白加工领域具有广阔应用前景。未来研究可结合其他诱变手段（如化学诱变）或蛋白酶组学分析，进一步优化突变株的酶系组成与协同作用。