综述：扩展显微镜与先进成像技术结合的应用综述

《Journal of Microscopy》：Review of expansion microscopy combined with advanced imaging modalities

　　扩展显微术（ExM）通过物理膨胀样品突破传统光学显微镜的分辨率限制，结合光片荧光显微术（LSFM）、刺激发射耗散（STED）、结构照明显微术（SIM）、单分子定位显微镜（SMLM）及荧光波动分析（FFSR）等技术，显著提升生物成像分辨率至纳米级。其优势包括简化设备、适用于复杂组织及多色成像，广泛应用于神经科学、癌症研究和细胞超微结构分析。未来需优化化学方法、标准化评估工具并拓展跨学科应用。

　　扩张显微镜（ExM）作为一种强大的高分辨率成像技术，通过物理放大生物样本，突破了传统光学显微镜的衍射极限，实现了对细胞结构和分子复合物的更清晰观察。ExM通过将样本嵌入可膨胀的聚合物网络中，并在化学交联后进行均匀膨胀，使生物样本在空间上被放大，从而提升显微镜的分辨率。与传统方法相比，ExM不需要复杂的光学设备或复杂的后期图像处理，其操作相对简单，适合多种生物样本的使用。自2015年首次提出以来，ExM迅速在多个领域获得应用，特别是在神经科学中，它使得从单细胞到整个生物体的成像成为可能。

在实现ExM的过程中，各个步骤对于最终成像结果的准确性和分辨率至关重要。例如，固定是确保样本结构稳定性的关键步骤，通常使用醛类试剂如甲醛、戊二醛等进行化学固定。然而，这些固定方法有时会破坏样本的分子结构，导致非均匀膨胀或结构丢失。为了克服这一问题，研究人员开发了低温固定（Cryo-ExM），通过快速冷冻和随后的冷冻替代处理，提高了样本的原生结构保留和抗原可及性。虽然这种方法在样本保护方面表现优异，但其成本较高且需要专门的设备和专业知识。

在样本锚定环节，研究人员使用化学试剂将生物分子与聚合物网络连接，确保在膨胀过程中这些分子能够被有效检测。一些研究已经开发了通用的锚定试剂，如甲基丙烯酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MA-NHS），使得ExM更易于应用。然而，某些蛋白质或小肽（如肌动蛋白结合的荧光探针phalloidin）由于缺乏赖氨酸残基而无法直接锚定，因此需要设计特殊的连接子（如TRITON）来引入可聚合的基团。这种策略不仅提高了锚定效率，还保证了荧光信号的完整性。

样本的聚合和膨胀是ExM的核心步骤。通过调整聚合物配方，研究人员能够控制样本的膨胀倍数和机械稳定性。例如，使用不同的单体、交联剂和引发剂组合，可以实现从4倍到20倍甚至更高的膨胀效果。然而，高膨胀倍数也会导致样本结构的变形，因此需要精确控制聚合过程中的温度和时间。此外，由于样本膨胀后含水量较高，机械稳定性较低，这使得样本在处理和成像过程中更加脆弱。因此，一些研究开发了迭代ExM（iExM）和蛋白质保留ExM（proExM）等变体，以实现更高的分辨率和更少的结构扭曲。

在样本均匀膨胀之后，需要对样本进行荧光标记，以便在后续成像中获得高分辨率的图像。选择合适的荧光探针和标记策略对于保证信号强度和分辨率至关重要。例如，一些研究发现，某些有机荧光染料（如Atto 565、Atto 488和Pacific blue）在膨胀后仍能保持较高的信号强度，而荧光蛋白（如GFP和mRuby2）则表现出较好的保留特性。然而，某些荧光染料（如氰基染料）在聚合过程中可能会失去荧光活性，因此需要谨慎选择。

将ExM与先进的荧光成像技术结合，如光片荧光显微镜（LSFM）、受激辐射损耗显微镜（STED）、结构照明显微镜（SIM）、单分子定位显微镜（SMLM）和基于荧光波动的超分辨率（FFSR）技术，可以进一步提升成像的分辨率和精度。例如，ExLSFM通过将ExM的样本放大与LSFM的快速成像特性结合，使得研究人员能够在减少光漂白和结构扭曲的情况下，对整个组织进行高分辨率成像。ExSIM则通过SIM的结构照明显微镜特性，实现了对亚细胞结构的高分辨率分析，适用于多种生物学问题，如研究细胞骨架和染色质结构。

ExSTED结合了ExM的样本放大和STED的超分辨率成像能力，使得研究人员能够以接近10纳米的分辨率观察生物结构。这种技术在研究细胞膜蛋白和细胞骨架结构方面具有显著优势，同时也被用于植物生物学和细胞黏附研究。ExSMLM则通过将ExM与单分子定位显微镜结合，实现了单分子级别的分辨率，使得研究人员能够观察细胞内的分子复合物和蛋白质相互作用。

此外，ExM与基于荧光波动的计算超分辨率方法（如SOFI和SRRF）结合，使得研究人员能够在不依赖昂贵设备的情况下，获得高分辨率的图像。这种方法特别适用于需要处理大量数据的实验，因为它可以利用低强度的荧光信号进行高分辨率重建，同时减少光漂白的影响。

ExM的未来发展还依赖于更广泛的传播和应用。随着机器学习和人工智能技术的进步，这些计算工具可以显著提高ExM图像分析的准确性和效率。此外，新型聚合物化学和锚定策略的开发将进一步提升ExM的灵活性和适用性。ExM的应用范围也在不断扩大，从传统的生物学和神经科学领域扩展到材料科学、化学、病理学和临床诊断等多个领域。通过建立国际性的ExM用户群体和共享标准化协议，研究人员可以更高效地利用这一技术，推动多学科的融合和创新。

总之，ExM为生物学研究提供了新的视角，使得研究人员能够在不依赖昂贵设备的情况下，实现纳米级别的成像。随着技术的不断进步和应用的拓展，ExM有望成为生物医学研究和多学科探索的重要工具。