固定在亚麻织物上的耐热β-葡萄糖苷酶的特性研究

《Journal of Dairy Science》：Characterization of thermostable β-glucosidase immobilized on linen fabric

　　乳糖水解用高温泉来源的β-葡萄糖苷酶共价固定于亚麻布，采用直接结合和EDmaint间隔臂两种方法。实验表明含间隔臂的LfEG-β-葡萄糖苷酶活性保留率76.6%，热稳定性显著优于直接结合的Lf-β-葡萄糖苷酶，在70℃下连续工作15次仍保持90%活性，且1年内4℃储存活性几乎不衰减。该固定化系统在乳清处理中实现6.4g葡萄糖/克催化剂，为食品工业可持续处理乳清废弃物提供新方案。

　　本研究成功地将一种来源于高温温泉宏基因组的热稳定β-葡萄糖苷酶固定在亚麻布上，开发出一种环保且可重复使用的生物催化剂，用于乳糖水解。这种酶来源于意大利那不勒斯附近的卡姆皮·弗莱格里火山区域的皮西亚雷利温泉，该地区以其极端环境而闻名，能够产生具有工业应用价值的强效生物催化剂。研究中采用了两种固定策略：直接共价结合（Lf-β-葡萄糖苷酶）和通过连接臂结合（LfEG-β-葡萄糖苷酶）。后者表现出更优异的酶活性，保留了76.6%的初始活性，并且在热稳定性和操作稳定性方面有所提升。无论是游离形式还是固定形式，酶的最适pH和温度基本一致，而固定形式在长期热稳定性和储存稳定性方面表现突出，能够在4°C下储存一年后仍保持全部活性。该固定催化剂在奶酪废液处理中表现出良好的效果，即使在15次重复使用后仍能保留90%的活性，产生超过6.4克的葡萄糖。这些发现表明，亚麻布作为一种可生物降解、低成本的载体，在食品生物技术领域具有广阔的应用前景。高效率和可重复使用的特性使得这种生物催化剂成为乳糖水解和利用乳制品工业副产品（特别是奶酪废液）的有吸引力解决方案，符合循环经济和环保生产模式的需求。

乳糖水解在乳制品工业中具有关键作用，尤其是在生产无乳糖产品和利用富含乳糖的奶酪废液方面。随着人们对乳糖不耐受的认识加深，牛奶和乳制品中的乳糖水解变得尤为重要。利用酶来降低乳糖含量不仅能够生产适合乳糖不耐受人群的产品，还能提高乳制品的附加值。然而，目前用于乳糖水解的β-半乳糖苷酶（乳糖酶）存在一些局限，如热稳定性差、pH适应范围窄以及对D-葡萄糖的显著抑制作用。因此，研究热稳定β-葡萄糖苷酶的应用显得尤为迫切，因为它可以在无需额外条件的情况下有效水解乳糖，从而减少乳糖含量，同时提高乳制品的加工效率。

本研究中使用的β-葡萄糖苷酶来源于温泉宏基因组，具有良好的热稳定性。通过与亚麻布的共价结合，该酶能够在多种应用中保持其活性和功能。亚麻布作为一种天然材料，具有强度高、吸湿性强、耐高温（可承受高达170°C的温度）和耐光等优良特性，相比棉纤维更具优势。此外，亚麻纤维的化学组成和定量比例也为其增强生物稳定性、提高吸湿性和水分保持能力提供了基础。通过氧化处理，亚麻布表面形成醛基，能够与β-葡萄糖苷酶的氨基形成稳定的席夫碱，从而实现酶的固定。这种固定方法不仅能够提高酶的稳定性，还能够在操作过程中减少酶的泄漏，便于产物的分离和回收。

在酶固定过程中，研究团队采用了两种不同的策略。第一种是直接将β-葡萄糖苷酶固定在氧化后的亚麻布表面，第二种则是在亚麻布与酶之间引入连接臂（如乙二胺和戊二醛）。实验结果显示，使用连接臂的LfEG-β-葡萄糖苷酶表现出更高的固定效率和活性保留率。具体而言，在使用400毫摩尔乙二胺时，该催化剂保留了76.6%的初始活性，而直接固定的方法仅保留了57.2%的活性。这表明，连接臂的引入有助于提高酶的固定效率，从而增强其在实际应用中的稳定性。

为了评估酶的活性，研究团队采用了基于乳糖水解初始速率的方法。实验发现，无论是游离形式还是固定形式的β-葡萄糖苷酶，其最适pH范围都在5.5至6.0之间，最适温度则接近90°C。这一结果表明，固定过程并未改变酶的最适pH和温度。此外，固定后的酶在长期热稳定性方面表现出显著提升，例如在70°C下进行6小时的处理后，其保留了68.1%的原始活性，而游离酶仅保留了11.1%的原始活性。这种稳定性提升使得固定酶在工业应用中更具优势，尤其是在需要高温操作的条件下。

除了热稳定性，研究团队还评估了酶的运行稳定性。在连续的乳糖水解反应中，Lf-β-葡萄糖苷酶在前3次运行中保持了较高的转化率，但在第8次运行后活性迅速下降，最终仅保留10%的活性。相比之下，LfEG-β-葡萄糖苷酶在前4次运行中保持了相对稳定的转化率，甚至在15次运行后仍能保留约41%的活性。这种显著的运行稳定性表明，通过连接臂固定的方法可以有效延长酶的使用寿命，提高其在实际应用中的经济性和可行性。

此外，研究团队还评估了固定酶的储存稳定性。在4°C下储存一年后，Lf-β-葡萄糖苷酶仍能保持其原始活性，而游离酶则在两个月内失去了88%的活性。这一结果表明，固定在亚麻布上的酶具有更长的储存寿命，有助于减少酶的频繁更换和浪费。同时，实验还发现，固定后的酶几乎没有泄漏，这表明其与载体之间的共价键具有良好的稳定性，不会因储存条件的变化而轻易断裂。

本研究的成果不仅为乳制品工业提供了一种新的乳糖水解解决方案，也为其他生物催化应用提供了新的思路。通过将热稳定β-葡萄糖苷酶固定在亚麻布上，研究人员成功开发出一种可重复使用、安全且环保的生物催化剂。这种催化剂能够在高温条件下保持活性，同时具备良好的储存性能，使其在食品加工和生物转化过程中具有显著优势。与传统的固定方法相比，亚麻布作为载体不仅成本低廉，而且具有良好的生物降解性，符合现代工业对可持续性和环保性的要求。

本研究还对其他相关酶的固定方法进行了比较。例如，有研究将β-葡萄糖苷酶固定在磁性纳米颗粒上，保留了79%的原始活性，并在10次重复使用后仍能有效水解乳糖，产生31%的半乳糖寡糖。同样，β-葡萄糖苷酶在二氧化硅纳米颗粒上的固定也表现出良好的稳定性，其在12次重复使用后仍能保留约75%的活性。然而，这些固定方法在储存稳定性方面仍不及本研究中采用的亚麻布固定策略。相比之下，亚麻布固定酶在储存一年后仍能保持全部活性，而其他固定酶在数月内便出现活性下降。

此外，研究团队还探讨了酶的抑制机制。实验发现，D-葡萄糖对β-葡萄糖苷酶具有竞争性抑制作用，其抑制常数接近游离酶的值。这一结果表明，固定后的酶与游离酶在抑制机制上具有相似性，但固定后的酶在热稳定性和运行稳定性方面表现更优。这种稳定性提升可能与固定过程中形成的化学键和连接臂有关，它们有助于保持酶的构象和活性，减少因环境变化导致的失活。

本研究的成果为乳制品工业提供了重要的技术支持。通过将热稳定β-葡萄糖苷酶固定在亚麻布上，研究人员不仅提高了乳糖水解的效率，还实现了酶的重复使用和低成本生产。这种固定方法的环保特性使其在循环经济和可持续发展方面具有显著优势。同时，固定后的酶能够有效地将奶酪废液转化为有价值的碳水化合物资源，减少废料处理成本，提高资源利用率。

总体而言，本研究通过将热稳定β-葡萄糖苷酶固定在亚麻布上，开发出一种高效的生物催化剂。该催化剂在多个方面表现出优异的性能，包括热稳定性、运行稳定性和储存稳定性。其使用不仅能够提升乳制品加工的效率，还能促进资源的循环利用，减少环境污染，符合当前工业发展的趋势。未来，这种固定方法有望在食品加工、生物燃料生产和药物合成等领域得到广泛应用，为可持续发展提供新的技术路径。