Aβ42淀粉样蛋白纤维体外组装群体的结构重建揭示与人类大脑来源淀粉样蛋白多态性高度相似的稀有物种

《Communications Chemistry》：Structural reconstruction of individual filaments in Aβ42 fibril populations assembled in vitro reveal rare species that resemble ex vivo amyloid polymorphs from human brains

　　本研究针对Aβ42淀粉样蛋白纤维结构多态性如何受组装环境影响这一关键问题，通过原子力显微镜对体外组装的Aβ42纤维群体进行单丝水平三维结构重建，绘制了不同缓冲条件下的多态性图谱。研究发现Aβ42纤维的多态性程度和群体异质性对组装环境高度敏感，同时鉴定出与阿尔茨海默病患者大脑来源的Aβ42淀粉样蛋白纤维结构高度相似的稀有物种，为体外研究体系与体内疾病相关结构的关联性提供了直接证据。

　　

在阿尔茨海默病(AD)患者的大脑中，存在一种被称为淀粉样斑块的细胞外沉积物，这些斑块主要由淀粉样蛋白纤维组成。这些纤维来源于淀粉样前体蛋白(APP)的切割产物，其中含有42个氨基酸的淀粉样β蛋白(Aβ₄₂)被认为是最容易聚集且具有神经毒性的片段。如同所有的淀粉样蛋白纤维一样，Aβ₄₂淀粉样蛋白纤维具有核心的交叉β分子结构，由垂直于纤维长轴堆叠的β链组成，形成原丝，进一步关联形成具有疏水核心的扭曲纤维。

尽管来自相同氨基酸序列，淀粉样蛋白纤维却展现出令人惊讶的结构多样性，这种现象被称为结构多态性。有趣的是，无论是在体外实验中还是在从患者大脑中提取的淀粉样蛋白纤维中，都观察到了不同的结构多态性。特别是从阿尔茨海默病患者大脑中纯化得到的Aβ₄₂纤维，即使在同一样本中也存在多种左旋扭曲的多态性。然而，Aβ₄₂淀粉样蛋白纤维可能采用的结构多态性范围尚未被系统绘制，不同的局部环境如何影响这些结构多态性的形成也尚不清楚。

为了量化Aβ₄₂形成的纤维群体的结构变异，并绘制可能形成的纤维结构范围，研究人员需要以足够高的细节解析样本群体中的单个纤维。原子力显微镜(AFM)成像此前已被用于证明可以通过分析样本中每个单个纤维来获得形态特征分布。最近，研究团队还开发了通过AFM图像数据重建三维结构的方法，用于绘制多态性分布和量化群体异质性。

在这项发表于《Communications Chemistry》的研究中，Liam D. Aubrey等研究人员通过在三种最常用的缓冲盐条件(磷酸钠、HEPES和Tris，中性pH)下重组Aβ₄₂形成的纤维，应用单纤维结构分析方法绘制了Aβ₄₂的多态性组装图谱。研究发现，在所有测试条件下，某些类别的纤维多态性是保守的，但纤维结构的总体多样性对组装条件的微小变化都很敏感，无论是群体异质性的大小还是形成的丝状物种类型。令人兴奋的是，通过将单个丝状结构匹配到冷冻电镜衍生的结构数据，研究人员在这些异质性群体中发现了稀有纤维物种，这些物种与从人脑中纯化的Aβ₄₂淀粉样蛋白多态性显示出显著相似性。

关键技术方法

研究首先表达和纯化了重组Aβ₄₂单体，确保其具备预期的生物物理、化学和毒性特性。通过文献分析确定了Aβ_{42研究中最常用的三种缓冲条件(20mM磷酸钠pH 8.0、磷酸钠pH 7.4、Tris pH 7.4和HEPES pH 7.4)进行纤维组装。利用峰值力轻敲模式AFM对形成的纤维进行形貌成像，避免成像力依赖的压缩变形。采用接触点重建(CPR-AFM)方法从拓扑AFM图像重建单个丝状体的三维结构，量化形态参数(平均纤维高度、螺旋特性等)。通过聚集层次聚类分析基于交叉截面形状和螺旋对称性对纤维结构进行分类。将AFM重建的单个纤维三维表面包络与EMDB中沉积的Aβ冷冻电镜衍生结构图谱进行相似性比较，使用自定义的距离评分dξ量化结构相似性。}

Aβ42纤维群体结构变异量化揭示对组装条件敏感的高度结构多态性

对400个单个纤维(每种条件100个)的三维结构分析显示，在不同实验条件下组装的Aβ₄₂纤维群体具有高度多态性和异质性。平均纤维高度分布和二维等高线图分析表明，尽管使用的组装条件相似，但群体异质性存在差异。

磷酸盐缓冲液(特别是在pH 8.0时)倾向于形成更宽、扭曲频率更低的丝状体，这可能由更高的原丝间关联频率促进。相比之下，Tris缓冲的反应产生的扭曲模式范围比其他测试条件更广，但纤维间平均高度变异较小。HEPES缓冲液中的组装产生的纤维宽度和扭曲变异总体最小。右手扭曲纤维在所有四种组装条件下仍然很少观察到，仅占分析纤维的10.3%。

通过定义异质性指数(HI)定量比较四个纤维群体，显示从高到低的异质性顺序为：pH 8.0磷酸钠缓冲液(HI=3.23±0.15 SE)、pH 7.4磷酸钠缓冲液(HI=3.15±0.19 SE)、pH 7.4 Tris缓冲液(HI=2.71±0.28 SE)和pH 7.4 HEPES缓冲液(HI=2.61±0.19 SE)。

体外多态性Aβ42结构群体包含从离体人脑样本中发现的纤维结构

研究进一步验证了异质性Aβ₄₂纤维群体是否包含在人类中发现的淀粉样蛋白纤维结构。通过计算400个AFM衍生的三维重建结构与EMDB中21个冷冻电镜衍生的Aβ多态性结构图谱之间的d_ξ距离值，进行8400对成对比较。

令人惊讶的是，在8400对排名中显示最高相似性(d_ξ距离得分低于0.5)的前三对中，有两个是与II型多态性结构匹配的单个纤维，一个是与在人脑样本中看到的Aβ₄₂的I型多态性结构匹配的单个纤维。匹配I型多态性的单个纤维及其父集群占单个纤维观察值的0.5%(2/400)，匹配II型多态性的两个单个纤维及其父集群占观察值的1.25%(5/400)。使用随机生成的AFM纤维数据进行的对照分析证实，偶然获得阳性匹配的概率非常小。

研究结论与意义

本研究证明Aβ₄₂淀粉样蛋白纤维群体具有高度多态性，且对组装条件敏感。通过应用AFM成像和单丝CPR-AFM，可以量化淀粉样蛋白群体内的结构变异、多态性和异质性。更重要的是，研究发现体外形成的异质纤维群体中的稀有物种与在离体人脑患者样本中观察到的物种相匹配，支持了疾病和生理相关的淀粉样蛋白物种可以在体外形成的观点。

研究揭示的Aβ₄₂多态性组装景观对组装条件表现出惊人的敏感性，多态性分布可以通过组装条件的微小变化而发生改变。然而，数据显示一组共同的多态性，包括疾病相关的多态结构，可以在不同条件下存在，尽管多态性分布存在敏感性。这些发现将体外和体内结构数据联系起来，并将淀粉样蛋白的结构变异、多样性、异质性和分子群体水平特性置于焦点位置。

理解控制主要淀粉样蛋白多态结构形成、控制稀有物种形成以及控制结构变异程度和群体异质性的因素，都是更全面理解淀粉样蛋白分子群体在生物学中作用所必需的——无论是作为疾病的原因或结果，还是作为功能所需的结构。本研究建立的方法为未来表征、富集或靶向特异性(可能是稀有的)淀粉样蛋白多态物种的实验研究开辟了新途径，对解析这些结构在医学疾病背景下的组装机制以及为诊断和治疗研究开发提供有价值的实验工具具有重要意义。