《Scientific Reports》：Specific chromogenic assay for detection of hippuricase-positive bacteria and its validation in raw chicken meat samples
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空肠弯曲菌（C. jejuni）污染是全球食源性胃肠炎首因，传统PCR与茚三酮法在活菌检测、现场适用性及环保方面均受限。Biosynth与贝尔格莱德大学团队开发了一种仅两步、全水相的显色法，利用菌体内源hippuricase把4-HHA水解为4-HBA，再经HRP/H2O2或NaIO4氧化偶联4-AAP生成亮粉红色醌亚胺染料，10 min内即可目视判读。65份零售鸡肉盲样验证显示该方法对低至OD600 0.1的活菌仍灵敏特异，且不受样品本底catalase干扰；nLC-MS/MS在阳性样本中鉴定出7–9种C. jejuni特征蛋白，确证结果可靠。其操作简便、快速、绿色，为食品链现场筛查提供了可推广的新工具。
论文解读
“一块冰鲜鸡胸，表面洁净，却可能潜伏着10 CFU的空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni，C. jejuni）——全球近90%细菌性腹泻的元凶。传统实验室依赖PCR或茚三酮反应：前者检测DNA，无法区分死菌与活菌；后者虽看颜色，却与所有α-氨基酸反应，蓝紫混杂，假阳性高，且茚三酮本身刺激呼吸道。更棘手的是，鸡肉富含蛋白、脂肪，常含产catalase的正常菌群，它们分解H2O2，让依赖过氧化物酶的显色体系直接‘熄火’。如何能在菜市场、屠宰线甚至厨房里，用一瓶无色溶液，10分钟内判断‘有没有活的C. jejuni’？这正是Yao等人在《Scientific Reports》2025年第15卷报道的新故事。
作者把视线锁定在C. jejuni几乎独有的hippuricase（EC 3.5.1.32，马尿酸水解酶）。该酶可把底物hippuric acid切成甘氨酸与苯甲酸，但甘氨酸太“大众”，于是他们换用带羟基的4-hydroxyhippuric acid（4-HHA）。第一步，活菌内源hippuricase将4-HHA水解生成4-hydroxybenzoic acid（4-HBA）与甘氨酸；第二步，加入4-aminoantipyrine（4-AAP）和氧化剂——可以是HRP＋H2O2，也可以由葡萄糖＋葡萄糖氧化酶（GOD）原位产H2O2，甚至直接用NaIO4——4-HBA被氧化并与4-AAP偶联，生成粉红色醌亚胺染料，最大吸收505 nm。粉红色深浅与活菌量成正比，而hippuricase阴性的C. coli、E. coli、S. pyogenes等始终呈浅黄本底。
研究用到65份零售鸡肉样品，来自塞尔维亚贝尔格莱德6家超市的不同部位（肝、背、翅、腿、去皮胸）。样品经mCCDA选择性平板37 °C微需氧增菌48 h后，随机挑菌落用新体系检测，并以nLC-MS/MS鉴定C. jejuni特征蛋白作为金标准。
主要关键技术方法：
两步水相显色反应：4-HHA水解＋4-AAP氧化偶联
氧化剂三选一：HRP/H2O2、GOD/葡萄糖、NaIO4
微需氧培养与mCCDA选择性分离
nLC-MS/MS蛋白组学验证（Orbitrap Exploris 240）
研究结果
“检测原理与反应体系优化”
——以C. jejuni DSM 4688为模板，比较三种氧化体系。结果显示1 mM H2O2、1 U/mL GOD或2–4 mM NaIO4均能在10 min内达到平台吸收；其中NaIO4为单组分，操作最简单。
“灵敏度与catalase干扰评估”
——将菌液梯度稀释至OD600 0.1–0.9，所有catalase阳性C. jejuni仍呈明显粉红色，最低可目视检测限为OD600 0.1（约10 CFU/mL）。加入外源catalase的对照证实，H2O2虽被分解，但5 min内生成的醌亚胺已足够判读，不影响最终结果。
“其他hippuricase阳性菌适用性”
——Streptococcus agalactiae ATCC 12386（hippuricase阳性）呈阳性反应，而S. pyogenes（阴性）无显色，证明体系可拓展至B族链球菌等其它病原。
“与市售茚三酮产品比较”
——在同等菌量（OD600 0.2）下，Remel Hippurate disk需37 °C 30 min才出现浅蓝；Millipore strip甚至无可见色。而新体系室温10 min即呈鲜明粉红，灵敏度与速度均优于两者。
“鸡肉样品现场验证”
——65份样品中，11份（16.9%）显色阳性，其中鸡肝阳性率最高（30.7%），去皮胸最低（7.7%）。对阳性样本进行nLC-MS/MS，均检出7–9种C. jejuni特异性蛋白，包括major outer membrane protein（P80672）、flagellin B（P56964）、catalase（Q59296）等；阴性样本则检出C. coli、Acinetobacter等，但无hippuricase活性，与显色结果一致。仅1份样本初筛阴性但MS检出C. jejuni蛋白，复测仍不显色，提示可能菌量过低或酶活性丧失，整体假阴性率仅1.5%。
结论与讨论
该研究首次把hippuricase介导的4-HHA水解与4-AAP/氧化剂偶联显色策略引入食品中活性C. jejuni现场检测，解决了传统PCR“测基因不活”、茚三酮“测氨基酸非特异”以及catalase干扰三大痛点。水相反应、室温判读、目视或505 nm吸光度双读数，使其无需昂贵仪器即可在农场、超市甚至家庭厨房使用。鸡肝、背、翅等高菌量部位可优先筛查，为屠宰环节风险控制和精准消毒提供靶点。由于体系对S. agalactiae等同理阳性菌亦有效，未来只需在底物或氧化剂浓度上微调，即可扩展至围产期B族链球菌、环境军团菌等其它hippuricase阳性病原的监测。作者也指出，研究目前仅聚焦零售鸡肉，后续将在不同国家、不同蛋白丰富食品（火鸡、牛奶）以及跨实验室条件下进一步验证，以推动其成为ISO级别的标准快速检测方案。
