单核RNA测序揭示Stat2/Stat1在脑出血后小胶质细胞炎症反应中的核心转录调控作用

《Scientific Reports》：snRNA-seq reveals key transcription factors in the inflammatory response of microglia after intracerebral hemorrhage

　　本研究针对脑出血(ICH)后小胶质细胞炎症反应调控机制不清的问题，通过单核RNA测序(snRNA-seq)技术构建了ICH小鼠单细胞转录组图谱，鉴定出8个小胶质细胞亚型，发现Stat2和Stat1是调控炎症反应的关键转录因子(TFs)。体外实验证实抑制Stat1/Stat2可减轻小胶质细胞炎症反应，为ICH治疗提供了新靶点。

　　

脑出血(Intracerebral Hemorrhage, ICH)是一种具有高死亡率和高致残率的严重神经系统疾病，占所有卒中病例的10%-15%。其病理过程包括血肿导致的原发性损伤和神经炎症驱动的继发性损伤。作为大脑常驻免疫细胞，小胶质细胞在ICH后继发性损伤中扮演着双刃剑角色：一方面通过释放促炎因子加剧损伤，另一方面参与血肿清除和组织修复。然而，小胶质细胞在ICH不同阶段表现出显著的异质性，其动态反应的确切调控机制尚未完全阐明，这阻碍了靶向抗炎治疗策略的发展。

近年来，单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)技术在ICH研究领域取得突破，为解析细胞异质性和病理过程的时空动态提供了新视角。但传统scRNA-seq对组织解离应激敏感，易导致脆弱细胞类型（如特定神经元亚群）的丢失，可能掩盖关键病理阶段的转录信息。相比之下，单核RNA测序(single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq)能减少组织解离引起的细胞偏差和应激反应，尤其适用于冻存样本，成为scRNA-seq的有效替代和补充。

转录因子(Transcription Factors, TFs)是细胞功能的关键调控者。既往研究表明Nrf2、TonEBP等TFs通过NF-κB和JAK/STAT通路参与ICH发病机制，但这些发现未能解析特定小胶质细胞亚群内的差异TF调控机制及关键通路的时空动态。为此，吴卓金等研究人员在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果，旨在利用snRNA-seq技术构建ICH小鼠的单核转录组图谱，系统探索ICH后不同时期小胶质细胞的异质性，并深入研究参与炎症反应的关键转录因子。

研究人员采用自体血注射法建立小鼠ICH模型，在超急性期(6 h)、急性期(24 h)和亚急性期(72 h)采集血肿周围组织进行snRNA-seq分析。质量控制后获得45,608个单核转录组，通过无监督聚类分析鉴定出39个细胞簇，进而注释为5种主要细胞类型：星形胶质细胞(Astrocytes, AC)、小胶质细胞(Microglia, MG)、神经元(Neurons, Neu)、少突胶质细胞(Oligodendrocytes, OL)和少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte Progenitor Cells, OPCs)。神经元是检测到的最主要细胞类型，其次为少突胶质细胞和小胶质细胞，星形胶质细胞和OPCs数量较少。统计分析显示，星形胶质细胞在超急性期比例最高，OPCs在超急性期比例较高但在急性期显著下降，小胶质细胞在亚急性期比例最高，而神经元比例在各阶段保持相对稳定。

功能富集分析揭示了细胞类型特异性或共享的生物学功能：小胶质细胞主要富集于溶酶体通路，参与血肿清除和神经炎症调控；星形胶质细胞主要富集于NOD样受体信号通路，参与免疫监视和炎症小体激活；少突胶质细胞主要富集于脂质代谢过程，有助于维持髓鞘稳态；OPCs主要富集于细胞粘附和分化，促进谱系再生；神经元主要富集于氧化还原反应和神经系统发育，可能与ICH后的抗氧化防御相关。

针对小胶质细胞的深入分析鉴定出3,183个小胶质细胞和8个独特细胞簇(MG0-MG7)。MG0、MG3和MG4主要来源于假手术组和ICH-3d组，而MG2在ICH-6h组占59.57%，在ICH-1d组占37.84%。MG0高表达稳态小胶质细胞标志基因(Siglech、Cx3cr1、Tmem119、Hexb)，功能富集显示与信号转导、溶酶体和糖鞘脂生物合成相关，代表稳态小胶质细胞。MG2高表达趋化因子基因(Ccl3、Ccl4)和促炎细胞因子基因(Il12b、Il1b、Tnf)，直接富集于核心炎症和免疫应答通路(NF-κB、TNF和TLR通路)，是参与炎症和免疫反应的主要簇。MG3高表达巨噬细胞标志基因(F13a1、Mrc1、Dab2、Ms4a7)、传统M2标志基因(Arg1、Tgfbi)和代谢相关基因Apoe。MG4高表达细胞增殖相关基因(Top2a、Knl1、Kif11、Mki67)，代表增殖性小胶质细胞。

热图分析揭示了小胶质细胞亚群中M1/M2标志基因的时序动态变化：Ccl3、Cxcl10、Il6、Cd86等M1基因主要在ICH-6h上调，而Tgfb1、Arg1等M2相关基因在ICH-3d表达最显著。簇MG2-5在超急性期表现出较高的M1基因表达，而在急性和亚急性期M2基因相对上调，提示这些小胶质亚型在ICH进程中可能存在从M1向M2表型的转变。

为探索ICH后小胶质细胞的分化轨迹，Monocle2分析鉴定出五个 distinct microglial states(S1-S5)和两个主要分化路径。S1高表达与细胞粘附和神经发育相关的基因；S2高表达代谢相关基因(APOE、SAA3)和细胞增殖相关基因(Top2a)；S3特异性表达Ccl3、Ccl4、Ccl5、Tnf等促炎基因；S4以凋亡和内吞相关标志基因为特征；S5富集神经保护基因(Arg1、F13a1、Tgfbi)。随时间推移，小胶质细胞状态分布演变：假手术组主要处于稳态/增殖状态S1/S2，急性质变为炎症状态S3(ICH-6h、ICH-1d)，至ICH-3d时广泛分布于所有状态，其中吞噬/修复状态S4显著存在。

时间序列数据分析(TCseq)揭示了10个时间依赖性基因簇(Cluster 1-10)。Cluster 2、8、10与神经炎症过程和小胶质细胞激活动态显著相关。Cluster 2和10表现为超急性期上调后下调，富集于炎症反应，其中Cluster 2富集于免疫应答、TNF产生、NF-κB信号，参与启动促炎性小胶质细胞激活(M1样极化)；Cluster 10富集于TNF和IL-4产生的正向调控，提示瞬时免疫调节反应。Cluster 8在超急性和急性期持续表达，富集于炎症反应、翻译和基因表达调控，表明其在维持小胶质细胞活性和促进功能适应中的作用。

为识别调控小胶质细胞神经炎症的关键转录因子，研究人员采用SCENIC分析构建转录调控网络。重点关注与炎症和免疫反应相关的基因簇(Cluster 2、8、10)，发现小胶质细胞炎症反应的关键TFs包括Stat2、Stat1、Irf7、Nfkb1、Etv6、Cebpb、Batf和Bach1，其中Stat2和Stat1被鉴定为最核心的TFs。Stat2和Stat1共同调控大量干扰素刺激基因(Interferon-Stimulated Genes, ISGs)，包括泛素特异性肽酶18(Usp18)和多个三联基序蛋白(TRIM)家族成员。Irf7调控Cxcl10等趋化因子基因、Gbp2、Gbp5等干扰素诱导的GTP结合蛋白基因以及Il12b。富集分析表明，Stat2、Stat1和Irf7调控的靶基因主要参与炎症和免疫应答，显著富集于TNF信号通路和NOD样受体信号通路。

研究人员在体内外ICH模型中验证了Stat2和Stat1的作用。体内实验显示，ICH后6h和24h小鼠血肿周围组织Stat1和Stat2基因表达显著上调，72h时表达水平下降。体外实验中，用20μM Hemin处理原代小胶质细胞模拟ICH条件，通过siRNA转染分别抑制STAT1和STAT2表达。RT-qPCR结果显示，下调STAT1和STAT2抑制了促炎基因Cd86、Tnfa和Il6的表达，但对抗炎基因Tgfb无显著影响。免疫荧光结果显示，STAT1和STAT2的下调降低了ICH后小胶质细胞中传统M1标志物CD16/32的表达，而对Arg1无显著影响。这些结果表明Stat1/2敲低抑制了ICH后小胶质细胞的炎症反应。

本研究成功构建了ICH的单细胞转录组图谱，系统揭示了小胶质细胞在ICH后的异质性和动态变化，并鉴定出Stat1和Stat2是调控小胶质细胞炎症反应的关键转录因子。研究发现不仅深化了对ICH细胞异质性和小胶质细胞功能的理解，也为ICH机制研究和治疗策略开发提供了新的靶点和方向。特别是Stat1/Stat2作为JAK/STAT通路的核心成员，其抑制剂可能成为早期干预ICH后神经炎症的潜在治疗策略。未来研究可进一步探索这些转录因子的磷酸化状态及其相互作用，全面阐明它们在ICH及其他神经系统疾病炎症反应中的作用机制。

关键技术方法

本研究主要采用单核RNA测序(snRNA-seq)技术分析ICH小鼠模型血肿周围组织的细胞转录组。通过自体血注射法建立小鼠ICH模型，在超急性期(6h)、急性期(24h)和亚急性期(72h)采集基底节区组织样本。使用10x Genomics平台进行单核分离、文库构建和测序，数据通过Cell Ranger和Seurat软件进行质控、整合和聚类分析。采用SCENIC分析转录调控网络，Monocle2进行伪时间轨迹分析，TCseq进行时间依赖性表达模式分析。体外验证采用原代小胶质细胞培养，通过siRNA转染抑制STAT1/STAT2表达，利用Western blot、RT-qPCR和免疫荧光技术评估基因表达和蛋白水平变化。

研究结果

Identification of major brain cell types and their overall changes after ICH

通过snRNA-seq分析鉴定出5种主要脑细胞类型，发现神经元占比最高，小胶质细胞在亚急性期比例显著增加。功能富集显示不同细胞类型在ICH后发挥特异性作用，反映了ICH不同阶段细胞反应的异质性。

Unique gene expression characteristics of microglia subpopulations

鉴定出8个小胶质细胞亚群，发现MG2是主要的炎症反应簇，高表达促炎因子并富集于NF-κB、TNF和TLR通路。时序分析显示M1基因在超急性期上调，M2基因在亚急性期表达增强，提示小胶质细胞存在从M1向M2表型转变的动态过程。

Temporal diversification and functional reprogramming of microglia after ICH

伪时间轨迹分析揭示小胶质细胞五个功能状态和两个分化路径，显示从稳态/增殖状态向炎症状态转变，最终向吞噬/修复状态发展的动态过程。时间序列分析识别出10个时间依赖性基因表达模式，描绘了小胶质细胞从超炎症状态向损伤修复和稳态恢复转变的分子基础。

Identification of key transcription factors in microglial inflammatory response after ICH

SCENIC分析鉴定出Stat2、Stat1、Irf7等8个关键转录因子，其中Stat2和Stat1最为核心。这些TFs调控的靶基因主要富集于炎症和免疫应答通路，特别是TNF信号通路和NOD样受体信号通路。

Inhibition of Stat1 and Stat2 alleviates microglial inflammatory response post-ICH

体内外实验验证表明，抑制STAT1和STAT2表达可显著降低促炎基因表达和M1标志物水平，证实它们在调控小胶质细胞炎症反应中的关键作用。

研究结论与意义

本研究首次利用snRNA-seq技术构建了ICH小鼠模型的全面单核转录组图谱，系统揭示了小胶质细胞在ICH后的异质性和动态变化特征。研究发现不仅证实了小胶质细胞从促炎表型向抗炎/修复表型转变的经典理论，还首次将Stat2和Stat1鉴定为调控这一过程的核心转录因子。

特别值得注意的是，Stat2作为干扰素信号通路的关键调控因子，在炎症相关小胶质细胞中表现出最高的转录活性和最多的靶基因调控数量。Stat1/Stat2通过形成异源二聚体与IRF9结合形成ISGF3复合物，直接驱动ISGs的转录，进而放大炎症反应。这一发现将JAK/STAT通路与小胶质细胞特异性炎症反应直接联系起来，为理解ICH后神经炎症的分子机制提供了新视角。

研究局限性包括自体血ICH模型主要模拟血肿压迫和炎症反应，与临床自发性ICH存在差异；siRNA转染可能产生脱靶效应；功能验证仅限于体外模型，未深入探索信号通路详细机制。未来研究应关注这些转录因子的磷酸化状态及其相互作用，并争取在人类ICH标本中验证这些发现。

总体而言，这项研究深化了对ICH后细胞异质性和小胶质细胞功能的理解，提出了靶向Stat1/Stat2调控小胶质细胞炎症反应的新策略，为ICH的机制研究和治疗开发提供了重要理论基础和实验依据。