昼夜节律蛋白PERIOD通过锚定至核膜调控转录偶联DNA双链断裂修复的机制研究

《Molecular Cell》：Circadian PERIOD proteins regulate TC-DSB repair through anchoring to the nuclear envelope

　　本期推荐一项关于DNA损伤修复与昼夜节律调控交叉领域的重要研究。为解决转录活性区域DNA双链断裂（TC-DSBs）修复机制不清的问题，研究人员围绕PERIOD复合体蛋白如何调控TC-DSBs的核膜锚定开展系统性探索，发现PER2依赖的SUN1/NUP153介导的NE锚定通路促进RAD51加载和同源重组修复，并抑制DSB簇集和染色体易位。该研究首次揭示昼夜节律核心组件直接参与DSB空间定位调控，为拓扑异构酶抑制剂类化疗药物的时序应用提供理论依据。

　　

在真核细胞中，DNA双链断裂（Double-Strand Breaks, DSBs）是最严重的DNA损伤类型之一，若修复不当可导致染色体易位、基因组不稳定等后果。虽然全局基因组DSB修复（Global Genome DSB Repair, GG-DSBR）机制已被广泛研究，但发生在转录活性区域的DSBs（Transcription-Coupled DSBs, TC-DSBs）的修复路径仍不甚明确。近年来研究发现，TC-DSBs的修复具有独特时空调控特征，例如在人类核仁区发生的DSBs会被募集至核仁外围并与核膜（Nuclear Envelope, NE）接触。然而，RNA聚合酶II（RNAPII）转录基因座中产生的DSBs是否也存在类似的核膜定位现象，以及其背后的分子机制和生理意义，仍是领域内亟待解决的关键问题。

针对这一科学问题，法国图卢兹大学Gaelle Legube团队在《Molecular Cell》上发表了最新研究成果。该研究通过多参数筛选体系，首次发现昼夜节律核心调控复合体PERIOD的成员（包括PER2、NONO、DDX5等）是TC-DSBR的关键因子。进一步机制研究表明，PER2可直接结合于TC-DSBs，并通过与核内膜蛋白SUN1和核孔复合体蛋白NUP153相互作用，将DSBs锚定至核膜，进而促进RAD51介导的同源重组修复（Homologous Recombination, HR），同时抑制DSB簇聚和染色体易位。尤为重要的是，该通路受到昼夜节律振荡的直接调控：在PER2高表达时段（昼间），TC-DSBs更易被锚定至核膜并高效修复；而在PER2低表达时段（夜间），修复效率下降，DSB簇聚和基因组不稳定性显著上升。

在研究技术层面，作者整合了多种前沿方法：首先通过siRNA文库高通量筛选（涵盖γH2AX焦点强度、细胞存活率、染色体易位频率和DSB簇聚四个维度）鉴定TC-DSBR相关因子；利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和BLESS（Breaks Labeling, Enrichment on Streptavidin and Next-generation Sequencing）技术在全基因组水平验证蛋白与DSBs的结合；采用超分辨率活细胞成像（3D-RIM）和邻近连接 assay（PLA）观察DSB与核膜的动态互作；通过Hi-C技术分析染色体空间构象变化及D区室（D-compartment）形成；结合细胞周期同步化与昼夜节律同步化（地塞米松处理）模型，阐明节律振荡对修复过程的调控。

研究结果部分通过层层递进的实验设计揭示了关键发现：

“多参数筛选识别新型TC-DSBR因子”

通过siRNA文库筛选，研究人员发现PERIOD复合体成员（如PER2、NONO、DDX17等）的缺失会导致γH2AX焦点增强、DSB簇聚和染色体易位频率上升，提示这些蛋白在TC-DSBR中起保护作用。

“PERIOD蛋白参与TC-DSBR调控”

PER1和PER2的缺失显著增加DSB诱导后的γH2AX信号、易位频率和细胞死亡率，而核心节律转录因子BMAL1/CLOCK的缺失未产生类似表型，表明PER蛋白在DSB修复中具有非经典功能。

“PER2直接结合于HR倾向性TC-DSBs”

ChIP-seq分析显示，PER2特异性地富集于转录活跃的HR修复型DSBs周边，而BMAL1无此现象，证实PER2对TC-DSBs的直接招募作用。

“TC-DSBs通过PER2依赖机制靶向核膜”

活细胞成像与PLA实验显示，DSB诱导后53BP1/yH2AX焦点与核纤层蛋白LaminB1快速接触；PER2缺失显著削弱TC-DSBs与核膜的互作，表明PER2介导DSB的核膜定位。

“TC-DSBs锚定于SUN1与NUP153依赖的核膜位点”

SUN1（而非SUN2）和核孔蛋白NUP153在TC-DSBs处特异性富集，且其招募依赖PER2；超分辨率成像显示yH2AX焦点与SUN1/NUP153存在空间共定位。

“PER2/SUN1依赖的核膜锚定促进HR修复”

PER2或SUN1缺失不影响TC-DSBs邻近基因的转录抑制，但显著降低RAD51在DSB处的加载，表明该通路作用于 resection 下游，通过促进RAD51/RPA交换增强HR效率。

“PER2介导的DSB核膜锚定抑制DSB簇聚与D区室形成”

Hi-C分析显示，PER2缺失加剧DSB诱导的染色体区室化改变和D区室形成，并增加易位频率；SUN1、NUP153或STUbL蛋白RNF4的缺失产生类似表型，且与PER2缺失无叠加效应，提示它们处于同一通路。

“昼夜节律调控TC-DSBs应答及其核膜锚定”

昼夜节律同步化实验表明，在PER2低表达阶段，TC-DSBs的核膜锚定、RAD51加载效率下降，而yH2AX焦点面积和D区室相关基因激活增强，证实节律振荡直接调控该修复通路。

本研究系统阐明了昼夜节律核心蛋白PER2通过介导TC-DSBs的核膜锚定，从而促进HR修复并维持基因组稳定的新机制。该发现不仅揭示了DNA损伤应答与生物钟调控的直接交叉，还为基于拓扑异构酶抑制剂的 chrono-chemotherapy（时序化疗）提供了理论支持。未来针对PER2活性或核膜锚定通路的调控可能成为增强化疗疗效、降低副作用的新策略。